زراعة البكتيريا اللاهوائية لتقليل الكبريتات الفرعية من ثقافة أجار

الملخص

المصدر: أنور ، ز. ، وآخرون. تخصيب وكشف أنماط السموم من المطثية في عينات الأغذية بالتجزئة. J. Vis. خبرة. (2019).

في هذا الفيديو ، يتم استزراع البكتيريا المخفضة للكبريتات في وسط أجار يحتوي على الكبريتات ، حيث تنمو بشكل لاهوائي وتقلل الكبريتيت إلى كبريتيد الهيدروجين ، وتشكل رواسب سوداء مع أيونات الحديد. يتم عزل المستعمرات السوداء من عمق أجار باستخدام تقنيات معقمة ونقلها إلى وسط جديد لاستمرار الحضانة اللاهوائية.

البروتوكول

ملاحظة: تعتبر المطثية perfringens كائنا كائنا من مخاطر السلامة الحيوية من المستوى 2 (BSL2). على الرغم من أن جميع عينات الطعام لن تحتوي على C. perfringens ، يجب التعامل مع جميع العينات المستزرعة على هذا النحو. يجب ارتداء جميع الاحتياطات المناسبة ومعدات حماية الأفراد (PPE) في جميع الأوقات. تطهير جميع المواد قبل التخلص منها.

1. تحضير عدد الدورات في الدقيقة المعدل (متوسط perfringens السريع)

1. يمزج 30 جم / لتر من وسط ثيوغليكولات سائل ، 60 جم / لتر جيلاتين ، 5 جم / لتر بيبتون ، 5 جم / لتر جلوكوز ، 5 جم / لتر فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة ، 3 جم / لتر مستخلص الخميرة ، 1.5 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 0.5 جم / لتر كبريتات الحديدوز في ماء منزوع الأيونات حتى يتشتت بالتساوي. عادة ما نصنع دفعات 1 لتر.
2. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
3. اتركيه ليبرد إلى حوالي 40 درجة مئوية.
4. بمجرد أن يبرد عدد الدورات في الدقيقة ، أضف D-cycloserine إلى تركيز نهائي قدره 440 مجم / لتر.
   ملاحظه: يمكن تخزين تركيزات مخزون D-cycloserine المذاب في ماء معقم عند 50 مجم / مل عند -20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
5. نقل 10 مل من RPM إلى 15 مل من الأنابيب المخروطية بشكل معقم. يمكن تحضير RPM على دفعات وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
6. قم بتسخين عدد الدورات في الدقيقة إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.

2. جمع العينات وحضانة RPM

1. نقل الطعام إلى المختبر تحت درجات الحرارة المحيطة في غضون 1 ساعة. يمكن نقل الطعام في عبوات أصلية أو حاويات معقمة. إذا لم يتم اختباره على الفور ، يمكن تخزين الطعام في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. إذا كان ذلك متاحا ، لاحظ نوع الطعام وبلد المنشأ وفقا لملصق العبوة ، بالإضافة إلى أي معلومات أخرى ذات صلة.
2. قم بإزالة ما يقرب من 1.0-2.0 جم من الطعام وانقله إلى طبق بتري معقم أو ما يعادله. افرم ناعما بشفرة حلاقة أو مشرط معقم.
3. التلقيح في 10 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. اخلط جيدا.
   1. لاختيار الخلايا الخضرية ، انقل 5 مل من خليط PBS الغذائي إلى أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 10 مل من RPM. أغلق الغطاء بإحكام.
   2. لاختيار الجراثيم ، قم بتسخين 5 مل المتبقية من خليط PBS والطعام عند 85 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ثم انقله إلى أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 10 مل من دورة في الدقيقة. أغلق الغطاء بإحكام.
4. دوامة وعكس ثقافات RPM الغذائية لضمان الخلط الكامل.
5. أغلق الأنابيب المخروطية بإحكام ولف الأغطية بغشاء بارافين أو غلاف بلاستيكي لضمان بيئة لاهوائية.
6. احتضان طوال الليل (ON) عند 37 درجة مئوية.
7. في صباح اليوم التالي ، لاحظ أي تعكر أو تخمير في أنابيب RPM.

3. طلاء TSC (كبريتات التربتوز السيكلوسيرين) "شطيرة"

1. قم بتلقيح مزارع ON RPM في أجار TSC باستخدام تقنية "الساندويتش" (الشكل 1) الموضحة أدناه.
2. قم بإعداد TSC agar وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   1. قم بإعداد الطبقة الأساسية لألواح TSC عن طريق نقل 10 مل من أجار TSC المصهور إلى أطباق بتري معقمة واتركها تتصلب. يمكن تحضيرها مسبقا وتخزينها عند 4 درجات مئوية. تأكد من تسخين الألواح إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
   2. بالنسبة للطبقة العليا من لوحة TSC ، حافظ على أجار TSC المصهور المتبقي عند 40 درجة مئوية.
      ملاحظه: على الرغم من أن نقطة انصهار أجار أعلى من 85 درجة مئوية ، إلا أن الأجار المصهور يتجمد حوالي 32-45 درجة مئوية.
3. استرجع مزارع RPM ON بعناية وانقل 100 ميكرولتر إلى قاعدة أجار TSC. بسبب التخمير ، قد تتعرض بعض الثقافات لضغط. تأكد من ارتداء جميع معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
4. انشر لقاح RPM باستخدام حبات زجاجية معقمة أو موزع خلية.
5. اترك RPM "يمتص" في أجار TSC لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
6. انقل بعناية 20 مل من أجار TSC المنصهر 40 درجة مئوية إلى الطبق باستخدام ماصة مصلية.
7. استبدل غطاء طبق بتري واترك أجار TSC يتجمد تماما في درجة حرارة الغرفة.
8. اقلب طبق بتري واحتضنه عند 37 درجة مئوية.
9. إذا كانت التخفيفات التسلسلية مطلوبة ، فقم بإجراء تخفيفات لمزارع ON RPM في RPM طازجة ودافئة مسبقا قبل التلقيح في TSC أجار.

4. الزراعة الفرعية لمستعمرات تقليل الكبريتات

1. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة الألواح من الحاضنة وفحص نمو البكتيريا. قد تكون البكتيريا الهوائية موجودة على سطح الأجار. سيتم العثور على البكتيريا اللاهوائية وهي تنمو جزءا لا يتجزأ من الأجار. ستحول البكتيريا المخفضة للكبريتات الأجار المحيط باللون الأسود. محتملة C. perfringens ستكون مستعمرات اللونين سوداء ومضمنة في الأجار.
2. C. perfringens المستعمرات المشتبه بها ستكون إيجابية لتقليل الكبريتيت وستظهر سوداء ، مضمنة في الأجار. باستخدام قطارة معقمة تستخدم مرة واحدة ، "نتف" المستعمرات السوداء من الأجار وانقلها إلى 10 مل من عدد الدورات في الدقيقة الطازج في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. من المهم أن يتم طرد الهواء من القطارة قبل ثقب أجار.
3. إذا كانت هناك كمية كثيفة من نمو البكتيريا الهوائية على سطح اللوحة ، فاستخدم مكشطة خلايا معقمة لإزالة المستعمرات من مناطق محددة. يمكن أخذ عينات من مستعمرات C. perfringens المشتبه بها من نفس لوحة TSC إلى مزارع RPM منفصلة.
4. قم بتأمين أغطية الأنابيب المخروطية بإحكام ولفها بغشاء بارافين أو غلاف بلاستيكي. احتضان ON عند 37 درجة مئوية.

النتائج

الشكل 1: تخطيطي لتقنية شطيرة TSC agar

وسائط RPM التي تحتوي على C. perfringens البكتيريا مطلي بين طبقتين من أجار TSC من أجل تعزيز بيئة لاهوائية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
د-سيكلوسيرين	سيجما ألدريتش	طراز C6880
سكر العنب	سيجما لايف ساينس	D9434-250G
ماصات نقل يمكن التخلص منها	أي ماركة		اختر واحدة ذات طرف رفيع مثل ماصات النقل الحرارية العلمية المتاحة 137116M / EMD
مجموعات الدم والأنسجة DNeasy	كياجين	69504	ملاحظة: تم تقييم العديد من مجموعات استخراج الحمض النووي والبلازميد ، وأعطت هذه المجموعة أكثر النتائج المرجوبة.
حاضنة جافة	أي ماركة
وسط ثيوغليكولات سائل	ريميل	R453452
الجيلاتين من جلد الخنزير	سيجما لايف ساينس	جي 1890-500 جرام
كبريتات الحديد (II) هيبتاهيدرات	سيجما لايف ساينس	F8633-250 ز
الليزوزيم من بياض بيض الدجاج	سيجما ألدريتش	L6876	مطلوب لاستخراج الحمض النووي ، غير متوفر في المجموعة
بارافيلم أو غلاف بلاستيكي	أي ماركة
الببتون من الكازين والبروتينات الحيوانية الأخرى	سيجما ألدريتش	70173-100 جرام
قاعدة أجار Perfringens (TSC + SFP)	أوكسويد	سم 0587	اصنع TSC agar وفقا للتعليمات
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة	سيجما ألدريتش	P2222-100G
كلوريد الصوديوم	سيجما ألدريتش	إس-7653
مكشطة خلية معقمة	أي ماركة
موزعة الخلايا المعقمة	أي ماركة
أطباق بتري معقمة	أي ماركة
مستخلص الخميرة	سيجما ألدريتش	70161-100 جرام