الفصل القائم على الكروماتوغرافيا ذات الطبقة الرقيقة لنيوكليوتيدات (p) ppGpp المعزولة من البكتيريا التي تسببها الإجهاد

Abstract

المصدر: فرنانديز كول ، إل وكاشيل ، م. باستخدام الملصقات الإشعاعية لطبق ميكروتيتر لقياسات متعددة في الجسم الحي للإشريكية القولونية (p) ppGpp متبوعة بكروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة. J. Vis. خبرة. (2019)

يقدم هذا الفيديو بروتوكولا عالي الإنتاجية لقياس مستويات وديناميكيات النيوكليوتيدات البكتيرية للاستجابة للإجهاد ppGpp و pppGpp باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC). توفر الطريقة نهجا قويا وسريعا وفعالا من حيث التكلفة لقياس (p) ppGpp في المزارع البكتيرية في ظل ظروف الإجهاد المختلفة ، مما يتيح تحليلا عالي الدقة لفسيولوجيا البكتيريا والاستجابة الصارمة.

Protocol

1. كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة
   1. باستخدام قلم رصاص ناعم ، ضع علامة على خط أصل 1 سم من حافة لوحة الكروماتوغرافيا ذات الطبقة الرقيقة (TLC) مقاس 20 سم × 20 سم من البولي إيثيلينامين والسليلوز (PEI-cellulose) والتي تمت إزالتها بمقدار 5 سم من الأعلى بالمقص. ضع 5 ميكرولتر كقطرة على سطح جزيرة الأمير إدوارد لكل عينة. ابدأ في التطور التصاعدي دون السماح لهذه البقعة بالجفاف ، مما يحسن الدقة عن طريق تقليل الخطوط.
   2. قم بتطوير تصاعدي في خزان بطبقة من محلول 1.5 M KH₂PO₄ (الرقم الهيدروجيني 3.4) ضحل بدرجة كافية بحيث لا يلمس السائل بقعة العينة الأصلية. قم بتغطية الخزان بختم محكم الغلق واترك السائل يصعد إلى أعلى الصفيحة المشذبة ، 15 سم. لتحقيق الرقم الهيدروجيني 3.4 لمحلول 1.5 M KH₂PO₄ ، من الضروري ضبط الرقم الهيدروجيني بإضافة H₃PO₄.
   3. قم بإزالة الكروماتوغرام المطور بالكامل وجففه في الهواء في درجة حرارة الغرفة.
   4. قم بقص وتخلص من الجزء العلوي (الأس الهيدروجيني الأمامي) من الكروماتوجرامية التي تحتوي على ³²P الحرة في نفايات مشعة. يتم تمثيل هذا الجزء باللون الأصفر في الشكل 1 ويمكن تصوره بسهولة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. في حالة قياس نيوكليوتيدات (p) ppGpp فقط التي تهاجر بشكل أبطأ من ثلاثي فوسفات الجوانوزين (GTP) ، فمن المستحسن تشغيل معيار GTP مرئي للأشعة فوق البنفسجية ثم قص وتجاهل جزء علوي أكبر (أي شيء أعلى من GTP ، كما هو موضح في الشكل 1).
   5. قم بتعريض الأفلام الشعاعية الذاتية طوال الليل باستخدام شاشة فوسفورية.
   6. تطوير الفيلم. التقط إشارة شاشة الفوسفور وقم بقياسها باستخدام جهاز تصوير الفوسفور.
       
2. الكمية (p) ppGpp
   1. قياس البقع المشعة باستخدام الصورة J.
      ملاحظه: يمكن تطبيع كمية (p) ppGpp إلى الكمية الإجمالية لنيوكليوتيدات G التي لوحظت في كل عينة (الشكل 1). إذا كان مقدار الخلفية متجانسا ، فيمكن طرح فراغ واحد (المربع 4 من الشكل 1) لتصحيح الخلفية. إجمالي G هو مجموع GTP + ppGpp + pppGpp المكتشف. يفترض هذا التطبيع أن مستويات أحادي فوسفات الغوانوزين (GMP) وثنائي فوسفات الجوانوزين (الناتج المحلي الإجمالي) لا تكاد تذكر ، وهذا صحيح بالنسبة للإشريكية القولونية. توفر نسبة نيوكليوتيدات معينة إلى إجمالي G طريقة مهمة لتصحيح الاختلافات في حجم العينة المطبقة.

Results

الشكل 1: تحليل TLC التمثيلي. تمثيل تخطيطي للنتائج التي تم الحصول عليها بعد التصوير الشعاعي الذاتي وفحص الفوسفور بين عشية وضحاها باستخدام TLC. تظهر البقع المراد قياسها باللون الأحمر. يتم أيضا عرض صيغة حساب الكمية الكسرية ل ppGpp. يشي...

Materials