ثقافة البكتيريا أحادية الخلية داخل الحويصلات العملاقة

الملخص

المصدر: Morita, M., et al. زراعة الخلايا البكتيرية على مستوى الخلية المفردة داخل الحويصلات العملاقة. J. Vis. خبرة. (2019).

يوضح هذا الفيديو طريقة لزراعة ومراقبة الخلايا البكتيرية الفردية المغلفة داخل حويصلات عملاقة مثبتة على طبقة ثنائية دهنية مدعومة. يتيح النظام تصويرا مستقرا وطويل الأمد لديناميكيات نمو الخلية المفردة في بيئة مكروية محصورة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية.

البروتوكول

1. تحضير نظام مراقبة الحويصلة العملاقة (GV) (نظام زراعة الخلايا البكتيرية)

1. تحضير الحويصلات الصغيرة (SVs) لبناء غشاء ثنائي الطبقة مدعوم
   1. صب 20 ميكرولتر من محلول POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) و 4 ميكرولتر من محلول البيوتين-PEG-DSPE (1،2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [biotinyl (polyethyleneglycol) -2000) في أنبوب زجاجي.
   2. قم بتبخير المذيب العضوي عن طريق تدفق الهواء لتشكيل طبقة دهنية ووضع هذه العينة في مجفف لمدة ساعة واحدة لتبخر المذيب العضوي تماما.
   3. أضف 200 ميكرولتر من 200 ملي مولار جلوكوز في وسط 1x رطل (مرق لوريا بيرتاني) (المحلول المائي الخارجي ل GVs) إلى القارورة الزجاجية.
   4. لف الجزء الافتتاحي من القارورة الزجاجية بفيلم وصوتنيه في حمام بالموجات فوق الصوتية (120 واط) لمدة ساعة واحدة على الأقل.
   5. قم بإعداد SVs بطريقة البثق باستخدام الطارد الصغير وغشاء البولي كربونات بحجم مسام 100 نانومتر.
2. تحضير غرفة مصنوعة يدويا
   1. قم بحفر ثقب 7 مم بثقب مجوف على ختم مزدوج الوجه (10 مم × 10 مم × 1 مم).
   2. الصق الختم ذو الوجهين بالفتحة الموجودة على غطاء زجاجي (30 مم × 40 مم ، سمك 0.25-0.35 مم).
3. تحضير غشاء ثنائي الطبقة مدعوم على زجاج الغطاء في فتحة الغرفة
   1. أضف 30 ميكرولتر من محلول SV إلى فتحة الغرفة (المحضرة في القسم 2.2) واحتضن عند RT لمدة 30 دقيقة.
   2. اغسل الفتحة برفق مرتين باستخدام 20 ميكرولتر من وسط 1x LB يحتوي على 200 ملي مولار من الجلوكوز (المحلول المائي الخارجي ل GVs) عن طريق سحب العينات.
4. تثبيت GVs على الغشاء ثنائي الطبقة المدعوم على زجاج الغطاء في فتحة الغرفة
   1. أدخل 10 ميكرولتر من النيوترافيدين مع المحلول المائي الخارجي ل GVs (1 مجم / مل) في الحفرة واحتضان عند RT لمدة 15 دقيقة.
   2. اغسل الفتحة برفق مرتين باستخدام 20 ميكرولتر من وسط 1x LB يحتوي على 200 ملي مولار من الجلوكوز (المحلول المائي الخارجي ل GVs) عن طريق سحب العينات.
   3. أضف كل المحاليل التي تحتوي على GVs في فتحة الحجرة وأغلقها بغطاء زجاجي (18 مم × 18 مم ، سمك 0.13-0.17 مم) (الشكل 1 ب).
5. الملاحظة المجهرية لنمو الخلايا البكتيرية داخل القيمة العالمية
   1. اضبط نظام مرحلة التسخين المجهري بمجهر مقلوب مزود بعدسة موضوعية بفتحة عدسة رقمية (NA) 40x/0.6 مع مسافة عمل طويلة (الشكل 1 ب).
   2. ضع الغرفة على نظام مرحلة التسخين المجهري (الشكل 1 ب). احتضان GVs التي تحتوي على خلايا بكتيرية في الغرفة في ظل ظروف ثابتة لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية.
   3. التقط وسجل صورا مجهرية لنمو الخلايا البكتيرية داخل الأصوات العالمية كل 30 دقيقة باستخدام كاميرا علمية لأشباه الموصلات التكميلية لأكسيد المعادن (sCMOS).

النتائج

الشكل 1: نظام مراقبة زراعة الخلايا البكتيرية داخل GVs. (أ) يتم تثبيت GVs على غشاء مدعوم من خلال ارتباط البيوتين والنيوترافيدين على زجاج الغطاء. يتم احتضان GVs بواسطة نظام تدفئة. (ب) صورة لنظام المراقبة، بما ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
باكتوتريبتون	BD Biosciences	211705
كلوروفورم	واكو بيور كيماولز	032-21921
غطاء زجاجي (18 × 18 مم)	ماتسونامي جلاس إندي.	C018181	سمك 0.13-0.17 مم
غطاء زجاجي (30 × 40 مم)	ماتسونامي جلاس إندي.	طلب مخصص	سمك 0.25-0.35 مم
جهاز طرد مركزي لسطح المكتب	شركة هاي تك	أت تي101	نوع الدوار المتأرجح
ختم مزدوج الوجه (10 × 10 × 1 مم)	نيتوم	تي 4613
الجلوكوز	واكو بيور كيماولز	049-31165
المجهر المقلوب	أوليمبوس	تاسعة - 73
ميثانول	واكو بيور كيماولز	133-16771
نظام مرحلة التسخين المجهري	ضرب توكاي	تي بي -110R-100
الزيوت المعدنية	ناكالاي تسكي	23334-85
نيوترافيدين	ثيرمو فيشر العلمي	31000
عدسة موضوعية	أوليمبوس	LUCPLFLN 40× / 0.6 NA
أغشية البولي كربونات	أفانتي لليبيدات القطبية	610005
كاميرا sCMOS	أندور	زيلا 4.2 بلس	حجم المسام 100 نانومتر
كلوريد الصوديوم	واكو بيور كيماولز	191-01665
سكروز	واكو بيور كيماولز	196-00015
حمام بالموجات فوق الصوتية	كواحد	ASU-3D
مستخلص الخميرة	BD Biosciences	212750
أنبوب بلاستيكي بغطاء 0.6 مل	واتسون	130-806 درجة مئوية
أنبوب بلاستيكي مغطى سعة 1.5 مل	شركة سوميتومو باكليت	MS4265-م
1-بالميتويل -2-أولويل-إس إن-جليسرو-3-فوسفوكولين	أفانتي لليبيدات القطبية	850457ف
1،2-ديستيرويل سنجليسرو -3-فوسفوإيثانول أمين-ن- [بيوتينيل (بولي إيثيلين جليكول) -2000]	أفانتي لليبيدات القطبية	880129ف	الملوثات العضوية الثابتة
			البيوتين-PEG-DSPE