التحقيق في الاستجابة البكتيرية للإيثيلين باستخدام مركب يطلق الإيثيلين

الملخص

المصدر: Augimeri، R. V. et al. ، باستخدام المركب المطلق للإيثيلين ، 2-حمض كلورو إيثيل فوسفونيك ، كأداة لدراسة استجابة الإيثيلين في البكتيريا. J. Vis. خبرة. (2016)

يوضح هذا الفيديو تأثير الإيثيلين الناتج عن حمض 2-كلورو إيثيل فوسفونيك (CEPA) على نمو البكتيريا وإنتاج السليلوز. ينشط الإيثيلين مسارات الإشارات التي تحفز تخليق السليلوز ، مما يؤدي إلى تعزيز تكوين الحبيبات. تسلط هذه النتائج الضوء على الاستجابة البكتيرية للإيثيلين.

البروتوكول

1. فحوصات الحبيبات
   1. تنمو وتحديد مزارع المبتدئين Komagataeibacter xylinus في ثلاث نسخ:
      1. في ثلاث نسخ, تلقيح مستعمرة واحدة من إكسيلينوس كوماغاتايباكتر في 5 مل من شرام وهيسترين (SH) وسط (درجة الحموضة 5) مكمل مع 0.2٪ (الخامس/الخامس) تصفية السليلوز المعقمة. احتضان المزارع عند 30 درجة مئوية مع التحريض عند 150 دورة في الدقيقة حتى يتم الوصول إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) من 0.3 إلى 0.4 (حوالي 72 ساعة).
      2. حصاد مزارع البداية عن طريق الطرد المركزي (2,000 × جم ؛ 4 درجات مئوية ؛ 10 دقائق). اغسل الخلايا مرتين ب 5 مل من المحلول الملحي المعقم وأعد تعليق حبيبات الخلية. حافظ على الخلايا على الجليد.
      3. حدد الخلايا باستخدام غرفة عد Petroff-Hausser.
   2. تحضير الخلطات الرئيسية لتلقيح أطباق 24 بئرا:
      1. تكملة 60 مل من وسط SH (الرقم الهيدروجيني 7) مع 120 ميكرولتر من مخزونات حمض كلورو إيثيل فوسفونيك 2 و500 ملي مولار (CEPA) للحصول على تركيزات نهائية من CEPA تبلغ 0.01 و 0.1 و 1.0 ملي مولار على التوالي. استكمل 60 مل أخرى من وسط SH (درجة الحموضة 7) مع 120 ميكرولتر من المذيب المستخدم لإذابة CEPA. دوامة للخلط.
      2. قسم كل 60 مل من الوسط المحتوي على سيبا إلى أربعة حصص 14 مل. تلقيح ثلاثة من 14 مل من الاقتباس بالنسخ المتماثلة البيولوجية للثقافة البادئة بتركيز 10⁵ خلايا / مل. احتفظ بأنابيب بها خلايا على الجليد لمنع إنتاج السليلوز.
         ملاحظه: سيتم استخدام 14 مل المتبقية لآبار التحكم المعقمة.
   3. تلقيح لوحات 24 بئرا:
      1. اختبر كل علاج في صفيحته الخاصة بثلاثة صفوف من التكرارات البيولوجية وصفا من أدوات التحكم المعقمة (الشكل 1).
      2. باستخدام المزيج الرئيسي سعة 14 مل ، أضف 2 مل إلى كل من ستة آبار من طبق معقم مكون من 24 بئرا. أكمل للتكرارات البيولوجية الثلاثة والتحكم المعقم (الشكل 1). كرر كل علاج.
      3. أغلق الألواح بغشاء البارافين واحتضنها بشكل ثابت لمدة 7 أيام عند 30 درجة مئوية.
      4. حصاد وقياس الوزن الجاف للحبيبات (محصول السليلوز) (الشكل 1):
         1. انقل الحبيبات بشكل فردي إلى آبار صفيحة 6 آبار. لتحليل الخلايا، عالج الحبيبات ب 12 مل من هيدروكسيد الصوديوم 0.1 نيوتن (هيدروكسيد الصوديوم) عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
         2. قم بإزالة هيدروكسيد الصوديوم وتحييد الحبيبات عن طريق غسلها بالماء فائق النقاء لمدة 24 ساعة مع التحريض. قم بتغيير الماء كل 6 ساعات.
            ملاحظه: يجب أن تكون الحبيبات بيضاء عند الانتهاء من خطوة الغسيل.
         3. ضع أوزان الحبيبات على حصائر السيليكون وجففها عند 50 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لوزن ثابت. بمجرد أن تجف ، قم بإزالتها من الحصائر وقياس أوزانها على مقياس تحليلي لتحديد إنتاجية السليلوز البكتيري.

النتائج

الشكل 1: مخطط تدفق يوضح البروتوكول المستخدم لفحص الحبيبات وتحليلها. يتم تحديد وسط الأس الهيدروجيني 7 SH المكمل بالمخزون (60 مل) لثلاثة لقاحات بيولوجية منفصلة وتحكم معقم (14 مل لكل منهما). ثم يتم تصنيف هذه الثقافات إلى ستة نسخ مكررة تقنية (2 مل) في صفيحة مكونة من 24 بئرا ث...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
السليلاز من Trichoderma reesei ATCC 26921	سيغما	ج 2730	محلول مائي
حامض الستريك	بيوشوب	CIT002.500	لمتوسط SH
إيثيفون (≥ 96٪ ؛ 2-حمض كلورو إيثيل فوسفونيك)	سيغما	ج0143	مركب إطلاق الإيثيلين
الجلوكوز	بيوبيسيك	جي بي 0219	لمتوسط SH
Komagataeibacter xylinus ATCC 53582	ATCC	53582	ألفا بروتيوباكتيريوم المنتج للسليلوز البكتيري
فوسفات الصوديوم ، سباعي الهيدرات ثنائي القاعدة	بيوشوب	579.500 نقطة	فوسفات الصوديوم ، سباعي الهيدرات ثنائي القاعدة لوسط SH
كلوريد الصوديوم	بيوبيسيك	SOD001.1	كلوريد الصوديوم للمحلول الملحي والتحكم
فوسفات الصوديوم ، أحادي الهيدرات أحادي القاعدة	بيوشوب	مواصفات المنتجة306.500	فوسفات الصوديوم ، أحادي الهيدرات أحادي القاعدة لحل التحكم
هيدروكسيد الصوديوم	بيوشوب	700.500 ريال	هيدروكسيد الصوديوم لتعديل الأس الهيدروجيني
فيلم البارافين	بارافيلم	بي إم 996	لختم الألواح والقوارير
الببتون (البكتيريا)	بيوشوب	بيب403.1	لمتوسط SH
غرفة عد بتروف-هوسر	Hausser العلمي	3900	غرفة عد الخلايا البكتيرية
مرشح تعقيم البولي إيثر سلفون 0.2 ميكرومتر	VWR	28145-501	لتعقيم السيليلوز
مستخلص الخميرة	بيوبيسيك	جي 0961	لمتوسط SH