تضخيم البلازميد الانتحاري في مضيف بكتيري

الملخص

المصدر: Tomás, J. M., et al. توليد طفرات فارغة لتوضيح دور الجليكوزيل ترانسفيراز البكتيري في الحركة البكتيرية. J. Vis. خبرة. (2022).

يوضح هذا الفيديو التضخيم المعتمد على البادئ للبلازميد الانتحاري في الإشريكية القولونية. يتكاثر البلازميد ، الذي يحمل جينا لمقاومة المضادات الحيوية ، فقط في وجود بروتين بادئ مشفر بواسطة المضيف. بعد التثقيب الكهربائي والحضانة في وسط الاسترداد ، يتم طلاء الخليط على أجار يحتوي على مضادات حيوية. تبقى البكتيريا التي تحتوي على البلازميد على قيد الحياة ، حيث يسمح البروتين المبادئ بالتعبير عن الجين المقاوم للمضادات الحيوية للبلازميد.

البروتوكول

1. توليد طفرات فارغة في جينات جزيرة الارتباط بالجليكوزيل

ملاحظة: تعتمد طريقة الطفرات هذه على التبادل الأليلي لمنتجات الحذف داخل الإطار لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام ناقل الانتحار pDM428 (GenBank: KC795686.1). يعتمد تكرار ناقل pDM4 على lambda pir ، ويتم إكراه التبادل الأليلي الكامل من خلال استخدام جين sacB الموجود على المتجه.

1. بناء منتجات الحذف داخل إطار PCR.
   1. صمم زوجين من البادئات التي تضخم مناطق الحمض النووي في المنبع (بادئات A و B) والمصب (بادئات C و D) للجين أو المنطقة المختارة المراد حذفها (الشكل 1 ب).
   2. تأكد من أن البادئات A و D تحتوي على أكثر من 600 نقطة أساس في المنبع من البداية والمصب من محطة الجين أو الجينات المراد حذفها ، على التوالي. يحتاج هذان البادئاتان إلى تضمين موقع تقييد في نهاية 5 'للحصول على نوكلياز داخلي يسمح بالاستنساخ في pDM4.
      ملاحظة: يجب ألا يكون موقع التقييد المضمن في نهاية 5 'من البادئات A و D هو نفسه المواقع داخل مكبرات AB أو CD.
   3. تأكد من أن البادئات B و C موجودة داخل الجين المراد حذفه أو داخل الجين الأول والأخير ، على التوالي ، من المنطقة المراد حذفها. تأكد من أن كلا البادئات (B و C) موجودان في الإطار ويقعان بين 5-6 كودونات داخل الجين. علاوة على ذلك ، تأكد من أن كلا البادئات تشتمل في نهاية 5 على تسلسل تكميلي 21 نقطة أساس (الجدول 1) يسمح بربط مضخمات الحمض النووي AB و CD.
   4. قم بزراعة سلالة Aeromonas المختارة في 5 مل من مرق الصويا التربتيكي (TSB) طوال الليل (O / N) عند 30 درجة مئوية. استخدم مجموعة متوفرة تجاريا لتنقية الحمض النووي الجيني واتبع تعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد). حدد كمية 2 ميكرولتر من الحمض النووي المنقى باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
      ملاحظة: استخدم الماء المقطر المزدوج كفارغ، مع ضبط الأداة لتسجيل الامتصاص عند 260 نانومتر. سجل الامتصاص ب 2 ميكرولتر من الحمض النووي المنقى 3-5 مرات واحسب متوسط قراءة الامتصاص. استخدم قانون Beer-Lambert لحساب تركيز الحمض النووي ، حيث A = Ɛ.c.l. حيث "A" هو الامتصاص ، و "Ɛ" هو متوسط معامل الانقراض المولي للحمض النووي ، و "c" هو تركيز الحمض النووي ، و "l" هو طول المسار (راجع تعليمات الشركة المصنعة لمعرفة طول مسار كل أداة).
   5. استخدم 100 نانوغرام من الحمض النووي الكروموسومي المنقى كقالب في مجموعتين من تفاعلات البوليميراز المتسلسل غير المتماثلة مع بادئات AB و C-D (جدول المواد). استخدم نسبة مولارية 10:1 لأزواج البرايمر A:B وD:C.
      ملاحظة: تسمح PCRs غير المتماثلة بالتضخيم التفضيلي لخيط واحد من القالب على الآخر.
   6. تحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي في هلام الاغاروز 1٪. استخدم TAE (40 ملي تريس أسيتات ، 1 ملي مولار حمض إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)) كمخزن مؤقت لتشغيل الجل وإعداد طاقة 8 فولت / سم. لتصور الحمض النووي ، أضف بروميد الإيثيديوم (0.5 ميكروغرام / مل) إلى الجل وتصور منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام محطة تصوير حيوي (جدول المواد).
   7. قم بإزالة الأمبليكونات من الجل باستخدام مشرط ، وقم بتنقيتها باتباع بروتوكول الشركة المصنعة (جدول المواد) ، وقم بتحديدها.
   8. انضم إلى مكبرات AB و CD من خلال التسلسلات المتداخلة 21 نقطة أساس في نهاية 3 بوصات من منتجات PCR (الشكل 2). امزج 100 نانوغرام من كل أمبليكون (AB و CD) في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل مع كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR قبل AD) ، ولكن بدون بادئات ، وقم بالتمديد باستخدام برنامج التدوير الحراري. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرومتر من بادئات A و D إلى التفاعل (AD PCR) وتضخيمها كجزء واحد.
   9. قم بتحليل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (AD amplicon) عن طريق الرحلان الكهربائي في هلام agarose 1٪ باستخدام الشروط الموضحة في الخطوة 1.1.6 ، واستئصال الأمبليكون من الجل ، وتنقيته باتباع بروتوكول الشركة المصنعة ، وتحديد كمية الأمبليكون (جدول المواد).
2. بناء البلازميد المؤتلف pDM4 مع الحذف داخل الإطار.
   1. قم بزراعة O / N من الإشريكية القولونية cc18λ pir التي تحتوي على pDM4 في مرق ميلر Luria-Bertani (LB) (10 مل) مع الكلورامفينيكول (25 ميكروغرام / مل) عند 30 درجة مئوية.
   2. قم بتدوير المزرعة عند 5,000 × جم عند 4 درجات مئوية الحبيبات في 600 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم. قم بإجراء استخراج وتنقية البلازميد pDM4 باستخدام مجموعة تنقية البلازميد المتوفرة تجاريا ، باتباع تعليمات المزود (جدول المواد).
   3. هضم 1 ميكروغرام من pDM4 و 400 نانوغرام من أمبليكون AD لمدة ساعتين باستخدام نوكلياز داخلي قادر على هضم طرفي أمبليكون AD وموقع استنساخ pDM4 (الشكل 2). اتبع بروتوكول الشركة المصنعة للإنزيم لظروف التفاعل (جدول المواد).
   4. قم بتنظيف البلازميد المهضوم والأمبليكون باستخدام مجموعة أدوات تنقية الحمض النووي وتحديدها باتباع تعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).
   5. لمنع ارتباط pDM4 الخطي ، قم بإزالة مجموعة الفوسفات من كلا الطرفين 5 بوصات باستخدام إنزيم الفوسفاتيز القلوي باتباع تعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد). بعد ذلك ، قم بتنظيف البلازميد المعالج وتحديده باستخدام مقياس الطيف الضوئي كما هو موضح في الخطوة 1.1.4 (جدول المواد).
   6. اجمع بين 150 نانوغرام من pDM4 المعالج بالقلويات المهضومة والفوسفاتيز مع 95-100 نانوغرام من أمبليكون AD المهضوم عند ناقل مولي: نسبة إدراج 1: 4. قم بإعداد تفاعل الربط بحجم 15 ميكرولتر ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).
   7. احتضان O / N عند 20 درجة مئوية أو خلال عطلة نهاية الأسبوع عند 4 درجات مئوية. بعد الحضانة ، قم بإلغاء تنشيط T4 ligase عند 70 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
   8. استخدم الربط لإدخال البلازميد في سلالة الإشريكية القولونية MC1061λpir عن طريق التثقيب الكهربائي. استخدم البكتيريا المختصة بالكهرباء وكعبات التثقيب الكهربائي بفجوة 2 مم.
3. تحضير الإشريكية القولونية ذات الكفاءة الكهربائية والتثقيب الكهربائي للبلازميد المؤتلف pDM4
   1. تلقيح مستعمرة واحدة من بكتريا قولونية MC1061λpir سلالة في مرق ميلر Luria-Bertani (LB) ونمو O / N عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز 200 دورة في الدقيقة.
   2. قم بتخفيف 2 مل من المزرعة البكتيرية في 18 مل من مرق LB واحتضان عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز (200 دورة في الدقيقة) حتى يتم الوصول إلى كثافة بصرية (OD600) بين 0.4-0.6.
   3. بيليه الثقافة البكتيرية عن طريق الطرد المركزي عند 5,000 × جم و 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تخلص من المادة الطافية الحبيبات في 40 مل من H₂O المقطر المبرد.
   4. كرر خطوة التنظيف هذه مرتين أخريين لإزالة جميع أملاح الاستزراع. أخيرا, الحبيبات في 4 مل من H_{المقطر المبرد H 2}O ونقل 1 مل من المعلق إلى كل من أربعة أنابيب مخروطية 1.5 مل.
   5. بيليه الثقافة البكتيرية عن طريق الطرد المركزي عند 14,000 × جم و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات وقم بتعليق كل حبيبات في 100 ميكرولتر من H₂O. المقطر المبرد.
   6. أضف 3-3.5 ميكرولتر من خليط الربط إلى كل أنبوب واحتضنه على الثلج لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، انقل محتويات كل أنبوب إلى كوفيت تثقيب كهربائي مبرد بفجوة 2 مم وقم بتطبيق 2 كيلو فولت و 129 Ω وثابت زمني يبلغ حوالي 5 مللي ثانية.
      ملاحظة: قم بتبريد كوفيتات التثقيب الكهربائي مسبقا على الثلج. حافظ على البكتيريا على الجليد أثناء العملية بأكملها.
   7. بعد التثقيب الكهربائي ، أضف 250 ميكرولتر من وسط SOC (مرق Super Optimal مع قمع كاتابوليت) إلى كل من الكوفيتات الأربعة لاستعادة محتوياتها ، ونقلها إلى أنبوب مزرعة (حوالي 1 مل) ، واحتضان لمدة ساعة واحدة عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز (200 دورة في الدقيقة).
   8. قم بطلاء الخلايا المحولة على ألواح أجار Luria-Bertani (LB) المكملة بالكلورامفينيكول (25 ميكروغرام / مل) لضمان أن جميع المستعمرات التي تنمو على اللوحة تحتوي على العمود الفقري للبلازميد.

الجدول 1: الاشعال المستخدمة لبناء المسوخ الفارغ. يتم تسطير المناطق المتداخلة في البادئات B و C. موقع BamHI غامق في البادئات A و D.

اسم التمهيدي	التسلسل في اتجاه 5 إلى 3	تستخدم ل
أ. بيسيكولا AH-3
أ فلجي 1	CGCGGATCCGACTGTACCCGTCAATCA	متحولة FGI
ب-فلجي 1	CCCATCCACTAAACTTAAAACAGATCACCTCGAACTCGAAA
سي فلجي 12	TGTTTAAGTTgatgggggggaaccttaaatgccatga
د-فلجي 12	CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC
E-Flgi1	ACCCGCTCATTCGCTAT
إف فلجي 12	TCCGATTTTTCTGACTCAGGG
أ - إف جي آي 4	CGCGGATCCGATGCGTACGCTAATGAA	FGI-4 متحولة
ب-إف جي آي 4	CCCATCCACTAACTTAAACAACACATATTATTGCCCCTGAT
سي إف جي آي 4	TGTTTAAGTTgatgggatggagctaatcgttt
د-إف جي آي 4	CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC
E-FGI4	ATTTCCCTGCCAAATACG
إف جي آي 4	CCTGCCAACAGGATGTAAG
ناقل pDM4
pDM4 ل	AGTGATCTTCCGTCACAGG	عمليات الإدراج في متجه pDM4
بد.إم 4 ريڤ	AAGGTTTAACGG TTGTGGA

النتائج

الشكل 1: الكشف عن المعلوماتية الحيوية لمناطق الكروموسومات وتصميم التمهيدي. (أ) مخطط مناطق الكروموسومات المحددة في A. hydrophila AH-1 و A. piscicola AH-3. A. hydrophila AH-1 جزيرة الارتباط بالجليكوزيل تمثل السلالات التي تحتوي سوط جليكان عليها...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 مجموعة رد فعل جاهزة لتسلسل الدورة	الأنظمة الحيوية التطبيقية	4337455	تستخدم للتسلسل
بوليميراز AccuPrime Taq DNA ، دقة عالية	إنفيتروجين	12346-086	تستخدم لتضخيم شظايا AB و CD و AD
الاغاروز	كوندا بروناديز	8008	تستخدم للرحلان الكهربائي للحمض النووي
الفوسفاتيز القلوي ، أمعاء العجل (CIAP)	بروميجا	م 1821	تستخدم لإزالة الفوسفات في نهاية 5 '
باكتو أجار	بيكتون ديكنسون	214010	استخدم لتحليل الحركة
بامها	بروميجا	راند 6021	تستخدم لتقييد نوكلياز داخلي
BglII	بروميجا	راند 6081	تستخدم لتقييد نوكلياز داخلي
نظام BioDoc-It Imagin	الأشعة فوق البنفسجية		محطة التصوير الحيوي المستخدمة لتصور الحمض النووي
بيوتاك بوليميراز	بيولين	بيو 21040	تستخدم لفحص المستعمرات
Cytiva illustra GFX PCR طقم تنقية الحمض النووي وشريط الجل	سيتيفيا	28-9034-71	تستخدم لتنقية أمبليكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل وشظايا الحمض النووي.
إيدتا	تطبيق	131026.1211	تستخدم للرحلان الكهربائي للحمض النووي
كوفيتات التثقيب الكهربائي فجوة 2 مم	VWR	732-1133	تستخدم للتحويل
لوريا بيرتاني (رطل) ميلر أجار	كوندلاب	996	تستخدم لثقافة الإشريكية القولونية
مرق لوريا بيرتاني (رطل) ميلر	كوندلاب	1551	تستخدم لثقافة الإشريكية القولونية
نانودروب ND-1000	NanoDrop Techonologies Inc		مقياس الطيف الضوئي المستخدم لقياس كمية الحمض النووي
ريفامبيسين	تطبيق	ج2220,0005	تستخدم للتزاوج ثلاثي الأبوين
سوك متوسط	إنفيتروجين	15544034	تستخدم لاستعادة التثقيب الكهربائي
T4 الحمض النووي ليجاز	إنفيتروجين	15224017	تستخدم لتفاعل الربط
Veriti 96 بئر دورة حرارية	الأنظمة الحيوية التطبيقية		تستخدم لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل