عزل البكتيريا سالبة الجرام مع إدخالات الينقولات الجينومية

الملخص

المصدر: Kazi ، M. I. ، وآخرون ، إنشاء مكتبات إدخال الينقولات في البكتيريا سالبة الجرام من أجل تسلسل عالي الإنتاجية. J. Vis. خبرة. (2020)

يوضح هذا الفيديو اختيار وقياس وحفظ البكتيريا المتلقية سالبة الجرام التي تحمل إدخالات الينقولات بناء على مقاومة الكاناميسين.

البروتوكول

توليد المكتبة البكتيرية المتحولة النهائية

1. قم بإذابة جزء من التزاوج المجمد على الجليد.
2. تزاوج الألواح على ألواح أجار Luria-Bertani (LB) مقاس 150 مم مكملة بالكاناميسين بناء على وحدات تشكيل المستعمرات (CFU) المحسوبة في الخطوة 3.1. اضبط مستوى الصوت باستخدام LB لإنتاج 13,333 مستعمرة لكل 150 ميكرولتر قبل الطلاء.
   ملاحظه: تم تحديد عدد CFU هنا ليكون حوالي 10⁵ CFU / مل ، لذلك تم تعديل حجم التزاوج للحصول على 13,333 مستعمرة لكل لوحة. سيوفر هذا العدد الأمثل من المستعمرات على 30 لوحة لمكتبة متحولة عالية الدقة دون اكتظاظ اللوحات.
3. استخدم حبات زجاجية معقمة لنشر 150 ميكرولتر من التخفيف لكل لوحة على ألواح أجار Luria-Bertani مقاس 30 × 150 مم مكملة بالكاناميسين للحصول على 400,000 مستعمرة (الشكل 1 ج).
   ملاحظه: يمكن استخدام قضبان معقمة أو أي نوع من أدوات الموزعة المعقمة (أي الخرز الزجاجي) لنشر البكتيريا على الألواح.
4. تخلص من الأنبوب المستخدم الذي يحتوي على التزاوج الزائد.
   ملاحظه: تضيف دورات التجميد / الذوبان ضغوطا انتقائية على المزرعة البكتيرية ، والتي يمكن أن تحرف نتائج تجربة Tn-seq. استخدم حصة جديدة في كل مرة.
5. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 14 ساعة.
   ملاحظه: تم تحسين وقت الحضانة لمنع فرط النمو (ملامسة المستعمرات). يقترح تقليل النمو عن طريق تقليل وقت الحضانة.

تقدير كثافة المكتبة والتجميع للتخزين

1. عد CFUs على كل لوحة لتقدير إجمالي المسوخ في مكتبة الينقول. عد 20٪ من 3 لوحات على الأقل لتحديد تقدير عدد المستعمرات لمجموعة الألواح بأكملها (الشكل 2 أ). تأكد من أن المستعمرات لا تلمس مستعمرة أخرى.
2. بعد حساب العائد المقدر للمستعمرة ، أضف 3-5 مل من الجنيه (أو أكثر إذا لزم الأمر) إلى كل لوحة وكشط البكتيريا باستخدام أداة كشط معقمة. ملاحظه: تم استخدام حلقات التلقيح المعقمة لكشط الألواح بكفاءة.
3. معلقات بكتيرية تجمع من جميع الألواح إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل (الشكل 1 د). سيتطلب ذلك أنابيب مخروطية متعددة سعة 50 مل ، 3 على الأقل.
4. معلق بكتيري مجمع من الحبيبات باستخدام الطرد المركزي عند 5,000 × جم لمدة 7 دقائق.
5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 5 مل من LB مكملة ب 30٪ جلسرين.
6. Aliquot 1 مل من مكتبة الينقولات في مبردات وتخزينها عند -80 درجة مئوية.

النتائج

الشكل 1: تخطيطي لبناء مكتبة الينقولات المتحولة. (أ) الاقتران البكتيري. تم خلط سلالة "المتبرع" ، التي تشفر آلية التبديل ، مع السلالة "المتلقية". تم رصد الخليط على ألواح أجار Luria-Bertani (LB) وسمح له بالتزاوج لمدة 1 ساعة. (ب) توليد مكتبة الينقو...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أطباق بتري 150 مم × 15 مم	كورنينج	351058
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية المعقمة البولي بروبلين	فيشر العلمية	12-565-271
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	غير متاح	أمبير ، كانس
الإشريكية القولونية MFD Dap-	غير متاح	غير متاح	DAP Auxotroph ، يتطلب 600 ملي مولار من DAP المضاف خارجيا للنمو. يحتوي على آلات RP4 لنقل البلازميد. الناقل ل JNW68 (36).
قوارير مبردة ملولبة خارجيا	كورنينج	09-761-71
الخرز الزجاجي	كورنينج	72684
الجلسرين	فيشر العلمية	جي 33
حلقات التلقيح	فيشر العلمية	22-363-602	أداة الكشط
كاناميسين	فيشر العلمية	بي بي 906	تستخدم في 25 مجم / لتر
LB أجار ، ميلر	فيشر العلمية	BP1425
مرق LB ، ميلر	فيشر العلمية	BP1426
محلول ملحي مخزن من الفوسفات ، محلول 10X	فيشر العلمية	BP39920	مخفف إلى 1X