$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. التحول الطبيعي
ملاحظه: تم استخدام مشتق N315 ، N2-2.1 كمتلقي. في هذه السلالة ، تم تكرار موضع sigH للتعبير عن SigH بشكل أساسي. إذا لم تكن علامة المقاومة المراد نقلها كلورامفينيكول، فيمكن استخدام pRIT-sigH (سمR) للتعبير عن SigH. يستخدم البلازميد المنقى أو مستخلص الحمض النووي الكامل من S. aureus COL-45 المكتسب من CFR كحمض نووي متبرع للتحويل.
- تحضير الحمض النووي للمتبرع
- قم بزراعة COL-45 طوال الليل مع الرج عند 37 درجة مئوية في قارورة 300 مل تحتوي على 50 مل من مرق الصويا التربتيكي (TSB) المكملة ب 32 مجم / لتر من الكلورامفينيكول. مزرعة بكتريا قولونية HST04 تحمل بلازميد pHY300 (TetR) لاستخراج البلازميد لتجربة التحكم.
ملاحظه: يفتقر HST04 (dam- / dcm-) إلى جينات ميثيلاز الحمض النووي. يمكن أيضا استخدام سلالات تقليدية أخرى تحتوي على ميثيلاز الحمض النووي لتحضير المتبرع بالحمض النووي ، لأن حالة مثيلة الحمض النووي لا تؤثر على كفاءة التحول. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام بلازميد pT181 المنقى من سلالة S. aureus COL كعنصر تحكم إيجابي لمقايسة التحول. - اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي (8,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية).
- استخرج البلازميدات باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي البلازميد أو طريقة تنقية الحمض النووي التقليدية لتنقية الحمض النووي بالكامل.
- حدد كمية الحمض النووي المنقى بواسطة مطياف واحتفظ به عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظه: استخدم مستحضر DNA جديدا لمقايسة التحول ، وعادة ما يكون عمره أقل من أسبوع. مستحضرات الحمض النووي القديمة تقلل من كفاءة التحول.
- مقايسة التحول
- استزرع الخلية المتلقية (N2-2.1) بين عشية وضحاها في 5 مل من TSB عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز.
- انقل 0.5 مل من المزرعة الليلية إلى أنبوب سعة 1.5 مل. ترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي (10,000 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية).
- الخلايا ب 10 مل من وسط CS2 في أنبوب سعة 50 مل.
ملاحظه: CS2 وسيط هو وسيط اصطناعي كامل يحفز الكفاءة للتحول الطبيعي في S. aureus. الوسائط المختبرية القياسية الأخرى ، مثل TSB أو ضخ قلب الدماغ (BHI) ، ليست مناسبة للتحول. - ينمو البكتيريا عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز (180 دورة في الدقيقة) حتى المرحلة الأسية المتأخرة (حوالي 8 ساعات).
- احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي (5,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية).
- أعد تعليق الخلايا في 10 مل من وسط CS2 الطازج.
- أضف 10 ميكروغرام من البلازميد المنقى أو الحمض النووي للجينوم (الخطوة 1.1.4) إلى تعليق الخلية. رج العبوة عند 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة لمدة 2.5 ساعة.
ملاحظه: تؤدي أوقات الحضانة الأقصر باستخدام الحمض النووي (<2.5 ساعة) إلى انخفاض ترددات التحول. - اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي (5,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية).
- أعد تعليق الخلايا في 10 مل من وسط BHI. امزج معلق الخلية مع 90 مل من مكمل أجار BHI المذاب (55 درجة مئوية) مع 32 مجم / لتر من الكلورامفينيكول (أو 5 مجم / لتر من التتراسيكلين في تجربة التحكم). يسكب المزيج في أطباق بتري مقاس 90 مم. تبرد بسرعة واترك الأجار يتصلب.
- احتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية لمدة يومين.
- قم بتكرار المستعمرات المتولدة (المحولات) عن طريق نقل المستعمرات (باستخدام أعواد الأسنان) إلى ألواح أجار BHI الجديدة التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة لتأكيد خصائص مقاومتها. تأكيد جين المقاومة المكتسب (cfr أو tetM) عن طريق المستمرة PCR.