تقييم الوفيات الناجمة عن البكتيريا المسببة للأمراض في يرقات C. ايليجانس

الملخص

المصدر: أندرسون ، كيو إل ، وآخرون. نظام C. elegans Pathosystem عالي الإنتاجية وعالي المحتوى وقائم على السائل. J. Vis. خبرة. (2018)

يوضح الفيديو مقايسا سائلا حيث تتعرض يرقات C. ايليجانس المعدلة وراثيا للبكتيريا المسببة للأمراض في صفيحة دقيقة. السموم البكتيرية التي تفرز في الوسط تحفز إجهاد المضيف والموت. صبغة الفلورسنت تلطخ الديدان الميتة ، مما يسمح بالقياس الكمي للوفيات على أساس التصوير لتقييم القابلية الوراثية أو المقاومة.

البروتوكول

1. إعداد مقايسة القتل السائل (البروتوكول الأساسي)

ملاحظه: هذا بروتوكول لسلالة بكتيرية واحدة ومصدر واحد للديدان.

1. باستخدام مكشطة الخلية ، قم بإزالة Pseudomonas aeruginosa من لوحة Slow Killing أو SK وأعد تعليقه في ~ 5 مل من S Basal. قم بالتوسع إذا لزم الأمر. قياس الكثافة البصرية للمعلق البكتيري باستخدام مقياس الطيف الضوئي (OD₆₀₀)
2. قم بإعداد 24 مل من المخزون المخفف من المتصورة الزنجارية في S Basal عند OD₆₀₀ ≈ 0.09 (تركيز نهائي 3X). انظر 4.6.2 للمحتوى النهائي لكل بئر ، وحجم حجم التخفيف البكتيري وفقا لذلك.
3. أضف 21 مل من وسائط القتل البطيء السائل (3 جم من كلوريد الصوديوم، 3.5 جم من البيبتون/لتر المكملة بكلوريد الكالسيوم₂ وMgSO₄ إلى تركيز نهائي قدره 1 ملليمتر). باستخدام ماصة متعددة القنوات ، انقل 45 ميكرولتر من البكتيريا والوسائط إلى كل بئر من صفيحة 384 بئرا.
4. اغسل الديدان من مصدرها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل واسمح للديدان بالاستقرار تحت قوة الجاذبية. استنشاق المادة الطافية إلى 5 مل. أعد التعليق بإجمالي 50 مل S قاعدي.
5. كرر الخطوة 1.4 مرتين.
6. باستخدام فارز الدودة ، قم بفرز ما يقرب من 22 دودة في كل بئر من اللوحة المكونة من 384 بئرا.
   ملاحظه: يسقط الإعداد كل دودة في ~ 1.1 ميكرولتر من السائل. 22 دودة ستصل إلى 25 ميكرولتر ، مما يجعل إجمالي حجم الفحص 70 ميكرولتر / بئر.
   1. يتكون التركيب النهائي لكل بئر من 70 ميكرولتر ، ويضاف 45 ميكرولتر من هذا الحجم كوسيط بكتيري (0.03 OD₆₀₀ بكتيريا في 24 ميكرولتر S Basal ، و 21 ميكرولتر SK مكمل ب CaCl₂ و MgSO₄). تتم إضافة 25 ميكرولتر الأخرى مع 22 ديدان.
   2. إذا كان الفرز المستخدم هنا (انظر جدول المواد) غير متوفر ، فيمكن تخفيف الديدان إلى تركيز نهائي قدره 1 دودة / ميكرولتر في S Basal وسحب 25 ميكرولتر / بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. ومع ذلك ، قد تظهر النتائج زيادة التباين. بدلا من ذلك ، من الممكن استخدام موزع سائل تمعجي ، كما وصفه ليونغ وزملاؤه.
7. بعد فرز الديدان في صفيحة 384 بئرا ، أغلق اللوحة بغشاء نفاذ للغاز واحتضان الألواح عند 25 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة.
8. في الوقت المطلوب ، استخدم غسالة صفيحة صغيرة لغسل الطبق المكون من 384 بئرا باستخدام S Basal بإجمالي 5 مرات.
   1. بعد الغسيل الثاني ، قم بشفط معظم الوسائط ، وترك ~ 20 ميكرولتر. قم بهز الألواح بقوة باستخدام دوامة صفيحة دقيقة لمدة 30 ثانية على الأقل لتخفيف أي حطام من قاع الآبار).
9. بعد الغسيل النهائي ، استنشق المادة الطافية حتى 20 ميكرولتر. أضف 50 ميكرولتر من صبغة الحمض النووي 0.98 ميكرومتر (انظر جدول المواد) / بئر للوحة 384 بئر ، للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.7 ميكرومتر.
10. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 - 16 ساعة. هذه الصبغة لن تلطخ سوى الديدان الميتة. بعد فترة الحضانة المطلوبة ، اغسل الأطباق باستخدام غسالة الصفيحة الدقيقة لإزالة أي بقعة زائدة (3 غسلات على الأقل).
11. للحصول على البيانات ، استخدم مقياس الطيف الضوئي أو المجهر الآلي لتصوير كل من الضوء المرسل والفلورة (إثارة 531 نانومتر وانبعاث 593 نانومتر).

المواد