زراعة وصيانة البكتيريا المعبرة عن الحمض النووي الريبي

الملخص

المصدر: أندرسون ، كيو إل ، وآخرون ، نظام C. elegans المرضي عالي الإنتاجية ، عالي المحتوى ، قائم على السائل. J. Vis. خبرة. (2018)

يوضح هذا الفيديو تحضير بكتيريا تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) التي تحمل البلازميدات لتثبيط التعبير الجيني المستهدف. يحدد خطوات اختيار بكتيريا RNAi ونموها وتحريضها لإنتاج ألواح تعبير dsRNA للمقايسات النهائية.

البروتوكول

1. تحضير بكتيريا تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi)

1. قم بإخراج السلالات المرغوبة من البكتيريا المحتوية على الحمض النووي الريبي أو نقلها بدبوس إلى ألواح أجار مرق الليسوجين (LB) التي تحتوي على مضادات حيوية مناسبة (كاربينيسيلين عند 100 ميكروغرام / مل وتتراسيكلين عند 15 ميكروغرام / مل لمكتبات Ahringer و Vidal) من مخزون مجمد.
   ملاحظه: عند العمل مع البكتيريا غير المسببة للأمراض، استخدم إما خزانة السلامة البيولوجية بمستوى السلامة الحيوية (BSL)-2 A/B أو غطاء التدفق الصفحي BSL-1 لضمان عقم الثقافات وتقليل فرصة التلوث المتبادل للمكتبة.
2. احتضان الألواح لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
3. قم بتخزين الأطباق على حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
   1. بعد أسبوعين ، تخلص من الألواح واستبدلها بأطباق حديثة.
4. اختبر سلالات RNAi متعددة بالتوازي عن طريق تلقيح مستعمرة واحدة بشكل فردي من كل استنساخ إلى 4 مل من LB المكمل بالكاربينيسيلين في بئر واحد من صفيحة بئر عميقة مكونة من 24 بئرا أو في أنبوب اختبار معقم.  
   ملاحظه: تم الإبلاغ عن التتراسيكلين لتقليل كفاءة الحمض النووي الريبي. لا تستخدمه في هذا الوسيط.
5. ضع ألواح بئر عميقة 24 بئرا في حاضنة اهتزاز محسنة لألواح متعددة الآبار واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة أثناء الرج عند 950 دورة في الدقيقة. ملاحظه: من الصعب الحصول على نمو بكتيري موحد في ألواح متعددة الآبار باستخدام حاضنة اهتزاز تقليدية. يجب أن تكون حاضنة الاهتزاز قادرة على الاهتزاز بمعدل 750 دورة في الدقيقة على الأقل حتى تنمو الثقافات بشكل صحيح. في حالة عدم وجود شاكر متخصص ، من الممكن زراعة كل ثقافة في أنبوب فردي. يمكن نقل الثقافات إلى صفيحة 24 بئرا للطرد المركزي بعد ذلك.
6. اجمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 2,000 × جم.
7. صب المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة ورجها بقوة. أعد تعليق بكتيريا الحمض النووي الريبي في 100 ميكرولتر من S القاعدي (5.85 جم كلوريد الصوديوم ، كلوريد الصوديوم ؛ 1 جم فوسفات ثنائي البوتاسيوم ، K₂HPO₄ ؛ 6 جم فوسفات أحادي البوتاسيوم ، KH₂PO₄ مذاب في 1 لتر من الماء فائق النقاء ومعقم بواسطة الأوتوكلاف).
8. الماصة تعليق البكتيريا في عدد مناسب من الآبار في صفيحة NGM متعددة الآبار (وسط نمو الديدان الخيطية ، 3 جم كلوريد الصوديوم ، 2.5 جم بيبتون ، 1 ملي كلوريد الكالسيوم ، CaCl₂ ؛ 1 ملي مولار كبريتات المغنيسيوم ، MgSO₄ ؛ 25 مل من الفوسفات المخزن المؤقت (الكمية لكل لتر: 132 مل من K₂HPO₄ (1 M) و 868 مل من KH₂PO₄ (1 م)) ، و 18 جم أجار لكل لتر من الماء) مكمل ب IPTG (الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside؛ تركيز نهائي 1 ملي مولار) والكاربينيسلين (التركيز النهائي 100 ميكروغرام/مل).
   1. استخدم 3.5 مل من وسائط NGM لكل بئر للوحة ذات 6 آبار ، أو 1 مل لكل بئر من لوحة 24 بئرا ، أو 150 ميكرولتر لكل بئر من لوحة 96 بئرا.
   2. استخدم 100 ميكرولتر / بئر من البكتيريا للوحة ذات 6 آبار ، أو 50 ميكرولتر / بئر للوحة مكونة من 24 بئرا ، أو 20 ميكرولتر / بئر للوحة ذات 96 بئرا. تركه يجف.
      ملاحظه: عادة ما يتم إجراء التجفيف في غطاء تدفق معقم لتعزيز التجفيف السريع والموحد. التجفيف المنتظم مهم جدا. تجنب الإفراط في الجفاف ، لأن الشقوق في الأجار تعزز حفر الديدان. هذا يؤدي إلى خسائر الديدان والانسداد المحتمل لأنظمة معالجة السوائل.
9. استخدم الأطباق المحضرة على الفور أو قم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين لاستخدامها لاحقا.
   ملاحظه: لمنع جفاف الألواح ، يمكن إغلاقها بغشاء بارافين بلاستيكي أو وضعها في حاوية محكمة الغلق بمنشفة ورقية مبللة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
24 كتلة RB عميقة	ثيرمو فيشر العلمي	CS15124
وسائط نمو الديدان الخيطية (NGM)			الكمية لكل لتر: 18 جرام أجار ، 3 جرام كلوريد الصوديوم ، 2.5 جرام بيبتون ، 1 مل كلوريد الكالسيوم (1 م) ، 1 مل كبريتات المغنيسيوم (1 م) ، 25 مل من الفوسبات العازلة ، و 973 مل من الماء ملي كيو
مرق ليسوجيني (رطل)	USBعلوم الحياة	L1520
إس بازال			الكمية لكل لتر: 5.85 جرام كلوريد الصوديوم ، 6 جرام فوسفات أحادي البوتاسيوم ، 1 جرام فوسفات ثنائي البوتاسيوم ، و 1 لتر من الماء ملي كيو
اجار	USBعلوم الحياة	أ 0930
كلوريد الصوديوم	USBعلوم الحياة	إس 5000
الببتون	USBعلوم الحياة	ص 3300
كلوريد الكالسيوم	USBعلوم الحياة
كبريتات المغنيسيوم	فيشر العلمية	إم 63-500
عازلة الفوسبات			الكمية لكل لتر: 132 مل من فوسفات ثنائي البوتاسيوم (1 م) و 868 مل من فوسفات أحادي البوتاسيوم (1 م)
فوسفات أحادي البوتاسيوم	أكروس أورجانيكس	7778-77-0
فوسفات ثنائي البوتاسيوم	USBعلوم الحياة	ص 5100