التحليل المجهري لنمو البكتيريا تحت الإجهاد باستخدام غرف الموائع الدقيقة

الملخص

المصدر: Cayron ، J. ، et al. تحليل متعدد النطاقات لنمو البكتيريا تحت علاجات الإجهاد. J. Vis. خبرة. (2019).

يوضح هذا الفيديو كيفية تحضير واستخدام لوحة الموائع الدقيقة لتصوير الخلايا البكتيرية في ظل ظروف الإجهاد. يحدد عملية إدخال مزرعة بكتيرية ووسط مضاد حيوي محفز للإجهاد ، يليه تحميل الخلايا والإعداد المجهري. ثم يتم استخدام التصوير بفاصل زمني في وضع تباين الطور لمراقبة تطور الخلايا الخيطية الممدودة ذات المحتوى المتزايد من الحمض النووي بسبب انقسام الخلايا المثبط.

البروتوكول

1. التصوير المجهري بفاصل زمني للموائع الدقيقة
   1. قم بإزالة محلول الحفظ من لوحة الموائع الدقيقة واستبدله بوسط جديد مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية ، كما هو موضح في دليل مستخدم برنامج الموائع الدقيقة.
   2. أغلق لوحة الموائع الدقيقة بنظام المشعب وانقر على زر التحضير.
   3. ضع لوحة الموائع الدقيقة مع نظام المشعب على مرحلة المجهر وقم بالتسخين المسبق عند 37 درجة مئوية لمدة ~ 2 ساعة قبل البدء في الحصول على الفحص المجهري.
      ملاحظه: تعد خطوة التسخين المسبق هذه أمرا بالغ الأهمية لتجنب تمدد غرفة الموائع الدقيقة ، مما قد يغير تركيز المجهر أثناء تجربة الفاصل الزمني ويعرض الحصول على الصورة للخطر.
   4. أغلق لوحة الموائع الدقيقة. استبدل الوسيط من البئر 8 ب 150 ميكرولتر من عينة الاستزراع واستبدل الوسط من البئر 1 إلى 5 بالوسط المطلوب مع أو بدون الكاشف المسبب للإجهاد.
   5. أغلق لوحة الموائع الدقيقة وضعها على مرحلة المجهر.
   6. على برنامج الموائع الدقيقة ، قم بتشغيل إجراء تحميل الخلية. تأكد من أن تحميل الخلايا مرض من خلال النظر تحت المجهر في الضوء المنقول. قم بتشغيل إجراء تحميل الخلية مرة ثانية إذا كانت كثافة الخلية في الغرفة غير كافية.
   7. قم بإجراء تركيز دقيق في وضع الضوء المنقول وحدد العديد من مجالات الرؤية التي تظهر البكتيريا المعزولة. من المهم اختيار الحقول غير المكتظة لتتمكن من مراقبة نمو الخلايا المعزولة بمرور الوقت (يوصى باستخدام ~ 10-20 خلية لكل 100 ميكرومتر مربع). سيؤدي ذلك أيضا إلى تسهيل اكتشاف الخلايا أثناء تحليل الصور.
   8. في برنامج الموائع الدقيقة ، انقر فوق الزر "إنشاء بروتوكول". قم ببرمجة حقن وسط النمو لمكافئ وقت 1-2 جيل للسماح للخلايا بالتكيف (اختياري). ثم قم ببرمجة حقن الوسط المسبب للإجهاد خلال 10 دقائق عند 2 رطل لكل بوصة مربعة ، متبوعا بالحقن عند 1 رطل لكل بوصة مربعة للمدة المطلوبة لعلاج الإجهاد. إذا كنت تنوي تحليل استعادة الخلايا بعد الإجهاد ، فقم ببرمجة حقن وسط نمو جديد للمدة المطلوبة.
      ملاحظه: في التجربة المعروضة هنا ، تم حقن السيفاليكسين لمدة 10 دقائق عند 2 رطل لكل بوصة مربعة ، تليها 50 دقيقة عند 1 رطل لكل بوصة مربعة. بعد ذلك ، تم حقن وسط النمو الطازج عند 2 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 10 دقائق ، تليها 3 ساعات عند 1 رطل لكل بوصة مربعة.
   9. قم بإجراء التصوير المجهري في وضع الفاصل الزمني مع إطار واحد كل 10 دقائق باستخدام تباين الطور في الضوء المرسل ومصدر ضوء إثارة 560 نانومتر لإشارة mCherry إذا لزم الأمر.
      ملاحظه: من المهم البدء في الحصول على الصور المجهرية في نفس الوقت الذي يبدأ فيه بروتوكول حقن الموائع الدقيقة.

المواد