تقييم الاحتشاد البكتيري باستخدام لوحة مثبطات التدرج

الملخص

المصدر: Guo, S., et al. قياس حركة احتشاد السطح البكتيري على ألواح التدرج المحرض. J. Vis. خبرة. (2022).

يوضح هذا الفيديو استخدام لوحة سرب متدرجة مزدوجة الطبقة لدراسة سلوك الاحتشاد البكتيري تحت تركيزات مثبطات متفاوتة. يتم تلقيح صفيحة بها مثبط تشكيل متدرج في الطبقة السفلية بالبكتيريا وتحضينها. يتم التقاط الصور على فترات منتظمة لتحليل تأثير تركيز المثبطات على حشد البكتيريا.

البروتوكول

1. تحضير لوحات سرب متدرجة

1. تحضير وسط سرب
   ملاحظة: تم استخدام تركيز أجار 0.7٪ (وزن / حجم) من وسط السرب في هذا البروتوكول.
   1. تحضير مسحوق مرق ليزوجيني (LB) مع أجار في قارورتين مخروطيتين ؛ تحتوي كل قارورة على 2 غرام من التربتون ، و 2 غرام من كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) ، و 1 غرام من مستخلص الخميرة ، و 1.4 غرام من أجار. أضف الماء المقطر المزدوج (ddH₂O) وحرك المعلق باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي. اضبط مستوى الصوت النهائي على 200 مل عن طريق إضافة ddH₂O إضافي.
   2. قم بتعقيم المحلول عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. استخدم غطاء نفاذه للهواء أو فيلم مانع تسرب للزجاجة مع فتحة تهوية
      ملاحظة: سوف يذوب أجار عند تسخينه في الأوتوكلاف.
   3. عندما تنخفض درجة الحرارة إلى 65 درجة مئوية ، امزج المحلول لضمان التجانس ، وانقل الوسط إلى حاضنة 65 درجة مئوية أو حمام مائي للاستخدام على المدى القصير.
2. تحضير وسط سرب الطبقة السفلية
   ملاحظة: وسط الطبقة السفلية هو خليط من وسط السرب ومحاليل مخزون محفز. يتم عرض صياغة صفائح سرب التدرج المحفز في الجدول 1.
   1. قم بإعداد محلول مخزون ريسفيراترول 100 ملي مولار عن طريق إذابة 114.12 مجم من مسحوق ريسفيراترول المجفف بالتجميد في 5 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، وقم بتخزين المحلول عند -20 درجة مئوية.
   2. تحضير محلول مخزون أرابينوز بنسبة 20٪ (وزن / حجم) عن طريق إذابة 6 جم من مسحوق الأرابينوز في 30 مل من ddH₂O ؛ انتظر لمدة 10-15 دقيقة للسماح للأرابينوز بالذوبان ؛ وتخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة.
   3. أخرج الوسط من الحاضنة 65 درجة مئوية وضعه في درجة حرارة الغرفة ؛ اترك وسط السرب ليبرد حتى تبرد قارورة Erlenmeyer بدرجة كافية لتحمل (~ 50 درجة مئوية). لا تضع وسط السرب في درجة حرارة الغرفة لفترات طويلة ، لأن ذلك سيؤدي إلى تصلب الأجار.
   4. أضف الحجم المطلوب لمحلول مخزون المحفز إلى وسط السرب عند 50 درجة مئوية (الجدول 1). استخدم ماصة لتوزيع محلول المحفز بدلا من سكبه. قم بالتدوير برفق لخلط المحفز مع وسط السرب.
      ملاحظة: هذه الخطوة مخصصة للمحفزات التي لا يمكن تعقيمها. احرص على عدم إدخال فقاعات في الوسط.
3. تحضير ألواح سرب متدرجة مزدوجة الطبقة
   ملاحظة: وسيط الطبقة العليا هو وسط LB يحتوي على 0.7٪ (وزن / حجم) أجار.
   1. ضع ملصقات أطباق بتري مربعة مقاس 13 × 13 سم مع اسم المحفز والسلالات ، وادعم الأطباق على حافة الأغطية (الشكل 1 ب).
   2. أضف 40 مل من الطبقة السفلية الدافئة المتوسطة (50 درجة مئوية) باستخدام ماصة سعة 50 مل أو أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، بالنسبة لأطباق بتري مربعة مقاس 13 × 13 سم ، فإن الطبقة السفلية والطبقة العليا 40 مل مناسبة ؛ بالنسبة لأطباق بتري مربعة مقاس 10 × 10 سم ، فإن الطبقة السفلية 25 مل ووسط الطبقة العليا مناسبة.
   3. اترك وسط الطبقة السفلية للعلاج مكشوفا لمدة 1 ساعة داخل غطاء التدفق الرقائقي. لا تزعج أطباق بتري المربعة بينما يتجمد الوسط.
      ملاحظة: أثناء معالجة الطبقة السفلية ، يجب الحفاظ على وسط السرب الذي لا يحتوي على محفزات في حاضنة 65 درجة مئوية أو حمام مائي.
   4. بمجرد أن يتم ترسيخ الطبقة السفلية تماما ، قم بإزالة الأغطية وضع أطباق بتري المربعة داخل غطاء تدفق رقائقي.
   5. أضف 40 مل من وسط الطبقة العليا الدافئ (50 درجة مئوية) باستخدام ماصة 50 مل أو أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
      ملاحظة: لا يحتوي وسيط الطبقة العليا على محفزات.
   6. عالج الألواح ذات الطبقة المزدوجة على سطح الطاولة ، مغطاة ودون إزعاج لمدة 1 ساعة. قم بتخزين الألواح المحضرة في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة. ملاحظة: ستؤدي أوقات المعالجة الأطول إلى تقليل محتوى الرطوبة وتقييد حركة الاحتشاد.

2. نمو الإشريكية القولونية K12 و P. aeruginosa PAO1

1. قم بإعداد 500 مل من وسط LB عن طريق إضافة 5 جم من التربتون و 5 جم من كلوريد الصوديوم و 2.5 جم من مستخلص الخميرة إلى ddH₂O ، وقم بتعبئة المحلول إلى 500 مل. قم بتعقيم المحلول في دورة السائل لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية ، وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية.
2. قم بإعداد 100 مل من 1.5٪ (وزن / حجم) وسط LB-agar بإضافة 1 جم من التربتون ، و 1 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.5 جم من مستخلص الخميرة ، و 1.5 جم من الأجار في ddH₂O وقم بتعبئة المحلول إلى 100 مل. قم بتعقيم المحلول في دورة سائلة لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية. انقل الوسط إلى حمام مائي 50 درجة مئوية لمنع الأجار من التصلب.
3. عندما تكون القارورة المتوسطة LB-agar مريحة للإمساك بها ، أضف 20 مل من وسط LB-agar إلى طبق بتري (قطره 10 سم) باستخدام ماصة 25 مل. اترك الطبق في درجة حرارة الغرفة طوال الليل ، وقم بتخزين لوحة LB-agar عند 4 درجات مئوية.
4. قم بتقييم المزارع المخزنة عند -80 درجة مئوية ، وخط الإشريكية القولونية K12 ، والإشريكية القولونية K12-YdeH ، و P. aeruginosa PAO1 ، و P. aeruginosa PAO1-YdeH سلالات على أطباق LB-agar Petri باستخدام حلقات التلقيح التي تستخدم لمرة واحدة. احتضن أطباق بتري مقلوبة طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
5. اختر مستعمرات مفردة لسلالات مختلفة من أطباق بتري ، وقم بتلقيح كل مستعمرة في 5 مل من وسط LB ، واحتضن المزرعة عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري مختبري تم ضبطه عند 220 دورة في الدقيقة.
6. عندما تصل كثافة الاستزراع إلى OD600nm ~ 1.0 ، قم بإزالة المزرعة من الخلاط وضعها في درجة حرارة الغرفة. اضبط كثافة الاستزراع على OD600nm = 1.0 ، كما هو موضح في الخطوة 3.2.1.

3. تلقيح وحضانة ألواح السرب المتدرجة

1. تحضير آبار التلقيح
   ملاحظة: يمكن استخدام نماذج أغطية الطباعة ثلاثية الأبعاد القادرة على توليد آبار مفصولة بمسافة قياسية بدلا من الطريقة الموضحة أدناه.
   1. ضع علامة على مواضع البئر على ورق A4 ، كما هو موضح في الشكل 1C. اضبط ثلاثة تركيزات اختبار في طبق بتري مربع واحد مع اثنين أو ثلاثة مكررات.
   2. ضع ورق A4 المميز أسفل لوحة متدرجة صلبة. ادفع الجانب الأوسع من طرف الماصة سعة 100 ميكرولتر إلى السطح المتوسط شبه الصلب في الموضع المحدد. اضغط على طرف الماصة حتى يصل إلى الجزء السفلي من وسط الطبقة العليا.
   3. عندما يلامس الطرف الجزء السفلي ، لا تطبق أي قوة رأسية على الحافة ؛ قم بتدوير الطرف برفق لعزل محتوى البئر الأسطواني.
   4. حرك أطراف الماصة أفقيا على مسافة صغيرة جدا للسماح بتدفق الهواء إلى المساحة الضيقة الموضوعة جانبا. اضغط على الطرف بإصبع السبابة لمنع تدفق الغاز داخل الطرف أثناء الإمساك بالماصة باستخدام الإبهام والإصبع الأوسط.
   5. اسحب الطرف للخارج عموديا ، مع الحفاظ على محتوى البئر في الحافة أثناء سحبه للخارج.
      ملاحظة: إذا انزلق محتوى البئر ، فضع ضغطا أكبر قليلا بإصبع السبابة لإغلاق الطرف تماما.
   6. كرر الخطوات من 3.1.2 إلى 3.1.5 في كل موضع محدد. قم بتغطية لوحة السرب قبل التلقيح.
2. تلقيح واحتضان لوحة التدرج
   1. اضبط كثافة ثقافة النمو بين عشية وضحاها إلى OD600nm = 1.0.
   2. ماصة 80 ميكرولتر من ثقافة النمو بين عشية وضحاها في كل بئر. لا تسكب الثقافة البكتيرية خارج الآبار.
   3. لف الألواح بغشاء مانع للتسرب. للمراقبة طويلة الأمد (3-5 أيام) ، لف الألواح بشريط مطاطي معقم للمختبر.
      ملاحظة: الشريط المطاطي أقل عرضة للكسر.
   4. ضع دورق مملوء ب ddH₂O في الحاضنة للحفاظ على الرطوبة داخل الحاضنة. احتضان ألواح السرب المتدرجة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: لا تحتضن ألواح السرب رأسا على عقب ؛ سيؤدي ذلك إلى تسرب الثقافة البكتيرية من الآبار.
   5. قم بتصوير لوحة السرب مباشرة بعد التلقيح ، مسجلة هذا على أنه نقطة زمنية 0 ساعة.

4. تصوير احتشاد سطح البكتيريا

1. أخرج ألواح السرب ، واحدة تلو الأخرى ، من الحاضنة كل 12 ساعة ، مع إمساك اللوحة أفقيا ، وضعها في نظام تصوير الجل (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: لا تترك بصمات الأصابع على سطح الألواح ؛ امسك جانب لوحة السرب بقفازات نظيفة.
2. حدد وضع تصوير الجل ؛ تعريض لوحة السرب للضوء الأبيض ؛ واضبط البعد البؤري لإعطاء أوضح رؤية للأسراب.
   ملاحظة: استخدم نفس البعد البؤري لجميع اللوحات في دفعة معينة.
3. عزز سطوع الأسراب للحصول على ملاحظة واضحة عن طريق ضبط وقت التعريض الضوئي إلى 300 مللي ثانية. اضبط العتبة لتقليل التداخل من ضوء الخلفية.
   ملاحظة: يتم ضبط العتبة على واجهة التشغيل لنظام تصوير الجل. زيادة القيم الموجودة على اليسار لتقليل التداخل من ضوء الخلفية ؛ تقليل القيم على اليمين لتحسين سطوع الأسراب. في هذا البروتوكول ، تتراوح المنطقة عادة بين 6,000 و 50,000.
4. احفظ ملف الصورة لمزيد من التحليل. سجل وقت التصوير ونوع المحفز واتجاه التدرج والسلالات في ملف .txt .

 

الجدول 1: مواصفات متوسطة سرب مزدوجة الطبقة.

الطبقة العليا متوسطة مرق / ليسوجيني وسط (لكل 100 مل)
التربتون: 1 جرام
كلوريد الصوديوم: 1 جرام
مستخلص الخميرة: 0.5 جرام
أجار: 0.7 جرام
الطبقة السفلية متوسطة / وسط يحتوي على محفز (لكل 100 مل)
التربتون: 1 جرام	تركيز العمل:	تركيز محلول المخزون:
كلوريد الصوديوم: 1 جرام
مستخلص الخميرة: 0.5 جرام	- ريسفيراترول: 400 ميكرومتر	- ريسفيراترول: 100 ملي
أجار: 0.7 جرام
محفز:	- أرابينوز: 0.5٪ (وزن / حجم)	- أرابينوز: 20٪ (وزن / حجم)
- محلول مخزون ريسفيراترول: 400 ميكرولتر	أو 1٪ (وزن / حجم)
- محلول مخزون الأرابينوز: 2.5 مل أو 5 مل

النتائج

الشكل 1: تخطيطي لإعداد لوحة سرب التدرج المحفز والتلقيح والحضانة. (أ) نمو بين عشية وضحاها للثقافة البكتيرية عند 37 درجة مئوية. (ب) سير عمل لوحة سرب متدرجة محفز مزدوجة الطبقة. ط) دعم أطباق بتري المربعة. ب) صب وسط الطبقة السفلية وتصلب في درجة ح...

المواد