إنتاج البروتين المؤتلف والتعافي من الحويصلات المشتقة من البكتيريا

الملخص

المصدر: Streather ، B. R. ، et al. الإنتاج الأمثل وتحليل الحويصلات المؤتلفة المليئة بالبروتين من الإشريكية القولونية. J. Vis. خبرة. (2023)

يوضح هذا الفيديو إنتاج وعزل البروتينات المؤتلفة الموسومة بالببتيد النووي الحويصلي (VNp) من الحويصلات البكتيرية. يؤدي المحفز إلى إطلاق تعبير البروتين الموسوم ب VNp ، مما يؤدي إلى تكوين الحويصلة وتغليفها ، متبوعا بالطرد المركزي وصوتنة لاستعادة البروتين بكفاءة دون تحلل الخلية

البروتوكول

1. ثقافة الخلايا البكتيرية وتحريض البروتين

1. للحث على التعبير عن البروتين المؤتلف من محفز T7 ، أضف الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى تركيز نهائي يصل إلى 20 ميكروغرام / مل (84 ميكرومتر). يجب أن يحدث تحريض تعبير البروتين المؤتلف في مرحلة السجل المتأخر (أي الكثافة البصرية النموذجية ، OD₆₀₀ من 0.8-1.0) لإنتاج الحويصلات. ​
   ملاحظه: قد يختلف طول فترة الحث بين البروتينات ، حيث يصل بعضها إلى الحد الأقصى للإنتاج عند 4 ساعات والبعض الآخر بين عشية وضحاها (18 ساعة). حتى الآن ، تم الحصول على أقصى قدر من صادرات الحويصلة في المزارع بين عشية وضحاها.

2. عزل الحويصلة المؤتلفة

1. بيل الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 3,000 × جم (4 °C) لمدة 20 دقيقة.
2. لتعقيم الوسائط المحتوية على الحويصلة للتخزين طويل الأمد ، قم بتمرير وسائط الاستزراع التي تم تطهيرها من خلال مرشح بولي إيثر سلفون (PES) معقم وخالي من المنظفات 0.45 ميكرومتر.
   ملاحظه: لاختبار استبعاد الخلايا القابلة للحياة من المرشح المحتوي على الحويصلة ، ضع صفيحة على أجار مرق ليسوجين (LB) واحتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
3. لتركيز الحويصلات في حجم أصغر ، قم بتمرير الوسائط المعقمة المحتوية على الحويصلة من خلال مرشح استرات السليلوز المختلطة (MCE) المعقم والخالي من المنظفات 0.1 ميكرومتر.
4. اغسل الغشاء برفق ب 0.5-1 مل من المحلول الملحي المعقم بالفوسفات (PBS) باستخدام مكشطة خلوية أو موزعة بلاستيكية لإزالة الحويصلات بعناية من الغشاء. انقله إلى أنبوب ميكروفوج جديد. ​
   ملاحظه: يمكن تخزين الحويصلات المنقاة في وسائط معقمة أو PBS عند 4 درجات مئوية. هناك أمثلة على البروتينات المؤتلفة المخزنة في هذه الحويصلات لمدة 6 أشهر ، بهذه الطريقة ، دون فقدان في النشاط الأنزمي.

3. إطلاق البروتين القابل للذوبان من الحويصلات المعزولة

1. بمجرد عزل الحويصلات المحتوية على البروتين في الوسط المعقم / المخزن المؤقت ، قم بإخضاع أغشية الدهون الحويصلية للصوتنة باستخدام جدول زمني مناسب للجهاز (على سبيل المثال ، 6 × 20 ثانية دورات تشغيل وإيقاف تشغيلها) وأجهزة الطرد المركزي عند 39,000 × جم (4 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة لإزالة حطام الحويصلة. ملاحظه: يمكن استخدام الصدمة التناضحية أو العلاج بالمنظفات كبديل لكسر الحويصلات ، ولكن يجب مراعاة التأثير على وظيفة البروتين و / أو التطبيق النهائي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الأيزوبروبيل β-D-1-ثيوجالاكتوبيرانوزيد (IPTG)	ميلفورد	367-93-1
مرق ليسوجيني (رطل) / رطل أجار	مخزون المختبر	NA	10 جم / لتر تريبتون ؛ 10 جم / لتر كلوريد الصوديوم; 5 جم / لتر مستخلص الخميرة (1.5 جم / لتر أجار)
مرشح غشاء MF-Millipore (0.1 ميكرومتر ، MCE)	ميرك	VCWP04700
مرشح غشاء Millipore Express PLUS (0.45 ميكرومتر ، PES)	ميرك	HPWP04700
محلول ملحي مخزن من الفوسفات (PBS)	مخزون المختبر	NA