F نقل البلازميد واختيار المضادات الحيوية المزدوجة في الإشريكية القولونية

الملخص

المصدر: أردوغان ، ف. ، وآخرون ، فحوصات التزاوج المقترنة للتحليل الخاص بالتسلسل لبروتينات النقل المشاركة في الاقتران البكتيري. J. Vis. خبرة. (2017)

يوضح هذا الفيديو إجراء نقل البلازميد F من المتبرع إلى المتلقي E. خلايا قولونية باستخدام بلازميد الإنقاذ واختيار المترافق من خلال مقاومة مزدوجة للمضادات الحيوية. تتضمن العملية خلط المزارع البكتيرية ، والحضانة دون اهتزاز ، وتعطيل أزواج التزاوج ، والطلاء على وسائط انتقائية لتأكيد نقل البلازميد بنجاح.

البروتوكول

1. فحص التزاوج الاقترافي من المتبرعين XK1200 إلى متلقي MC4100

1. قم بإعداد مزرعة O / N من خلايا XK1200 pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-Gene في 20 مل من مرق الليسوجين المعقم (LB) مع 20 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول (سم) و 50 ميكروغرام / مل كانامايسين (كم) و MC4100 في 5 مل رطل مع 50 ميكروغرام / مل ستربتومايسين (Sm) باستخدام خلايا من مخزون الجلسرين أو مستعمرة مفردة على صفيحة أجار وماصة أو حلقة معقمة. تنمو الثقافات عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز 200 دورة في الدقيقة.
2. قم بعمل تخفيفات 1:70 من كل مزرعة O / N بشكل منفصل في 2 مل من LB المعقم بنفس المضادات الحيوية. أضف الجلوكوز إلى تركيز نهائي قدره 100 ملي مولار إلى جميع الخلايا المانحة. تنمو الخلايا إلى مرحلة منتصف السجل (OD₆₀₀ 0.5-0.7) عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
3. جهاز طرد مركزي (4,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية) لخلايا الحبيبات ، وتخلص من المادة الطافية ، واغسلها مرة واحدة باستخدام LB المعقم البارد لإزالة المضادات الحيوية ، وأعد تعليق الخلايا في 2 مل LB معقم على البارد.
4. في نسخ مكررة ، قم بتقسيم 100 ميكرولتر من كل مزرعة إلى 800 ميكرولتر من وسائط LB المعقمة والسماح لهم بالتزاوج عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة دون اهتزاز.
5. قم بتدوير الخلايا لمدة 30 ثانية لتعطيل أزواج التزاوج ووضعها على الجليد لمدة 10 دقائق لمنع المزيد من التزاوج.
6. باستخدام الخليط الدوامي و LB المعقم الطازج ، قم بإعداد 6 مخففات (^10-2 إلى ^10-7) من المترافن. حدد خلايا MC4100 pOX38-Tc Δgene :: Cm عبر الاقتران عن طريق اكتشاف 10 ميكرولتر من كل تخفيف على كل نصف من ألواح الأجار التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل سمتر و 20 ميكروغرام / مل سم ، كما في الشكل 1. كرر مع كلا الخليطين المكررين. حافظ على المنطقة معقمة واعمل بالقرب من اللهب. احتضان لوحات O / N عند 37 درجة مئوية.

النتائج

الشكل 1: مقايسة التزاوج لتقييم وظيفة الجين المستهدف في الاقتران. كانت الخلايا المانحة والمتلقية بكتريا قولونية XK1200 pOX38-TC ΔtraF:: Cm تم تحويلها باستخدام pK184-TraF و MC4100 على التوالي. تنمو المواد المتراف...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أطباق بتري	فيشر العلمية	FB0875713
المضادات الحيويه			التركيزات النهائية
الكلورامفينيكول (سم)	فيشر العلمية	BP904-100	20 ميكروغرام / مل
كاناميسين (كم)	BioBasic Inc.	DB0286	50 ميكروغرام / مل
الستربتومايسين (Sm)	فيشر العلمية	BP910-50	50 ميكروغرام / مل