تعطيل البكتيريا باستخدام أحادي النوكليوتيدات الفلافين المنشط بالضوء

الملخص

المصدر: تشنغ ، سي ، وآخرون. تعطيل مسببات الأمراض عن طريق التحلل الضوئي للضوء المرئي للريبوفلافين -5′-الفوسفات. J. Vis. خبرة. (2022)

يوضح هذا الفيديو طريقة لتقييم التأثيرات السامة ضوئيا لأحادي النوكليوتيدات الفلافين (FMN) على البكتيريا المسببة للأمراض. تتعرض المزارع البكتيرية لتركيزات متزايدة من FMN وتضيء بالضوء المرئي لتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) التي تلحق الضرر بالمكونات الخلوية. ثم يتم قياس البكتيريا الباقية لتقييم الانخفاض المعتمد على الجرعة في الجدوى.

البروتوكول

1. المكورات العنقودية الذهبية (S. aureus) قابلية الحياة بعد التحلل الضوئي FMN (الشكل 1)
   1. انقل مستعمرة من المغفورات العنقودية الذهبية (BCRC 10451) من صفيحة مستنبتة إلى 10 مل من مرق الليسوجيني المأخوذة في أنبوب اختبار مغطى بمسمار سعة 15 مل. ثقافة في شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
   2. انقل 0.5 مل من المزرعة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. أضف الماء المعقم إلى أنبوب الطرد المركزي لتخفيف المزرعة إلى كثافة بصرية تبلغ 0.5 عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) (~ 6 × 10⁷ وحدة تشكيل مستعمرة [CFU] / مل).
   3. انقل 0.5 مل من المزرعة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل ، وجهاز طرد مركزي عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق ، وصب المادة الطافية للحصول على حبيبات خلية.
   4. إضافة 1 مل من الفوسفات فيتامين بي 5 '(أو أحادي النوكليوتيد فلافين; FMN) - محلول مخزن مؤقت (30 و 60 و 120 ميكرومتر FMN في مخزن فوسفات البوتاسيوم [PB]) إلى كريات الخلية التي تم الحصول عليها كما في الخطوة 1.3 ، والدوامة. للتحكم في الإشعاع ، أضف 1 مل من PB وحده.
   5. انقل 1 مل لكل من محاليل الخلايا البكتيرية القابلة للحياة التي تحتوي على 30 ميكرومولار FMN و PB وحدها إلى أنابيب زجاجية ، وقم بتشعيعها بالضوء البنفسجي عند 10 واط / م² لمدة 30 دقيقة.
   6. انقل 1 مل لكل من محاليل الخلايا البكتيرية القابلة للحياة التي تحتوي على 30 و 60 و 120 ميكرومتر FMN و PB وحدهما إلى أنابيب زجاجية وتشعيعها بالضوء الأزرق عند 20 واط / م² لمدة 120 دقيقة. قم بإعداد أنبوب زجاجي آخر يحتوي على 1 مل من محلول الخلايا البكتيرية القابلة للحياة يحتوي على 120 ميكرومتر FMN وقم بتشعيعه بالضوء الأزرق عند 20 واط / م² لمدة 60 دقيقة.
   7. قم بإعداد أنابيب الاختبار كما هو موضح في الخطوتين 1.5 و 1.6 وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم السميك. تعمل هذه الأنابيب كعناصر تحكم مظلمة.
   8. احتفظ بغرفة التشعيع (بالإضافة إلى أدوات التحكم المظلمة) في غرفة باردة عند درجة حرارة 9 ± 1 درجة مئوية خلال فترة التشعيع التي تتراوح بين 30 و 120 دقيقة.
      ملاحظه: لا يمكن تجاهل الحرارة المنبعثة من مصابيح الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) ، حيث يمكن لرقائق LED الموضوعة داخل الكوب تسخين نظام التفاعل الضوئي أثناء تجارب التشعيع. لذلك ، أجريت التجارب في غرفة باردة يتم الاحتفاظ بها عند 9 ± 1 درجة مئوية.
   9. بعد التشعيع ، انقل 0.2 مل من كل محاليل من محاليل التفاعل إلى لوحة Luria agar (LA). انشر البكتيريا على الطبق بقضيب زجاجي على شكل حرف L واحتضنه طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
   10. احسب عدد الصفائح القابلة للتطبيق ومعدلات تعطيل المسرحية العنقودية الذهبية بعد النمو بين عشية وضحاها.

ملاحظه: معدل تعطيل S. أوريوس يتم حسابه على أنه النسبة المئوية للتخفيض, وهو ما يساوي [1 -I / D] ×100٪, حيث يشير I و D , على التوالي, عدد CFUs في العينة المشعة والتحكم في الظلام. يتم تعريف النسبة المئوية للتخفيض على أنه قيمة سالبة لمعدل التعطيل.

النتائج

الشكل 1: تأثير التحلل الضوئي FMN على S. aureus للحياة. يتم تعريف النسبة المئوية للتخفيض على أنها قيمة سالبة لمعدل التعطيل ل S. aureus المعالج ب (A) FMN تحت تشعيع الضوء الأزرق عند 20 و...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مصابيح LED زرقاء وخضراء وحمراء	شركة Vita LED Technologies Co.، تاينان، تايوان		تيار مستمر 12 فولت 5050
ثنائي ميثيل سلفوكسيد	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري	190186
ميزان حرارة الأشعة تحت الحمراء	شركة رايتيك سانتا كروز ، كاليفورنيا	ميتاتريدر 4
مرق رطل	شركة ديفكو ، نيوجيرسي
لام-ميثيونين	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري	1.05707
NBT	Bio Basic، Inc. ماركهام ، أونتاريو ، كندا
مزود الطاقة	شركة الصين للتكنولوجيا ، مدينة تايبيه الجديدة ، تايوان	YP30-3-2
ريبوفلافين 5 فوسفات	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري	ريفي 7774
آر نيز	نيو إنجلاند BioLabs، Inc. إبسويتش ، ماساتشوستس
عداد الطاقة الشمسية	شركة Tenmars للإلكترونيات ، تايبيه ، تايوان	TM-207
المكورات العنقودية الذهبية subsp. aureus	مركز جمع وبحوث الموارد الحيوية (BCRC) ، سينشو ، تايوان	10451
مطياف بصري للأشعة فوق البنفسجية	بصريات المحيط ، دنيدن ، فلوريدا	USB4000
مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية	شركة هيتاشي للعلوم عالية التقنية ، طوكيو ، اليابان	يو 2900
LED البنفسجي	لونغ هوي الالكترونية المحدودة ، دونغقوان ، الصين