القياس الكمي للتعطيل البكتيري الناجم عن الضوء من خلال توليد أنواع الأكسجين التفاعلية

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: تشنغ ، سي ، وآخرون. تعطيل مسببات الأمراض عن طريق التحلل الضوئي للضوء المرئي للريبوفلافين -5′-الفوسفات. J. Vis. Exp. (2022).

في هذا الفيديو ، يتم تشعيع خليط تفاعل مخزن مؤقت يحتوي على L-methionine و nitro blue tetrazolium (NBT) و flavin mononucleotide (FMN) بالضوء البنفسجي للحث على إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). هذا يؤدي إلى تعطيل البكتيريا وتشكيل فورمازان يمكن اكتشافه طيفيا.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (O₂ • ⁻) في المكورات العنقودية الذهبية

تحضير عينات المكورات العنقودية الذهبية .
قم بتخفيف الكثافة البكتيرية للعينات بالماء المعقم إلى كثافة بصرية تبلغ 0.5 عند 600 نانومتر (OD (الكثافة البصرية) ₆₀₀ ، ~ 6 × 10⁶ CFU (وحدة تشكيل المستعمرة) / مل). انقل 0.5 مل من المزرعة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق وصب المادة الطافية للحصول على حبيبات خلية.
أضف 0.1093 جم من L-methionine و 0.1 جم من NBT (كلوريد رباعي الزولويوم الأزرق Nitro) و 25 مل من FMN (أحادي النوكليوتيد فلافين) (400 أو 240 أو 120 ميكرومتر) إلى 75 مل من PB (مخزن الفوسفات العازل). لكل 1 مل من المادة المتفاعلة المطبقة ، فإن التركيزات النهائية ل FMN والميثيونين و NBT هي 100 (60 أو 30) × ^10-6 م و 7.3 × ^10-3 م و 1.2 × ^10-3 م ، على التوالي.
أضف 1 مل من كل محلول متفاعل (أي بتركيزات متفاوتة من FMN) إلى كريات الخلية التي تم الحصول عليها. قم بإشعاع المحاليل بالضوء البنفسجي عند 10 واط / م² لمدة 10 دقائق.
قم بالطرد المركزي للخليط عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق وصبب. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لاستخراج NBT المخفض. اكتشف الأنواع O₂•⁻ المنتجة من الامتصاص عند 560 نانومتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي
ثنائي ميثيل سلفوكسيد	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري	190186
ميزان حرارة الأشعة تحت الحمراء	شركة رايتيك سانتا كروز ، كاليفورنيا	ميتاتريدر 4
مرق رطل	شركة ديفكو ، نيوجيرسي
لام-ميثيونين	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري	1.05707
NBT (كلوريد النيترو الأزرق رباعي الزوليم)	Bio Basic، Inc. ماركهام ، أونتاريو ، كندا
مزود الطاقة	شركة الصين للتكنولوجيا ، مدينة تايبيه الجديدة ، تايوان	YP30-3-2
ريبوفلافين 5 فوسفات	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري	ريفي 7774
عداد الطاقة الشمسية	شركة Tenmars للإلكترونيات ، تايبيه ، تايوان	TM-207
المكورات العنقودية الذهبية subsp. aureus	مركز جمع وبحوث الموارد الحيوية (BCRC) ، سينشو ، تايوان	10451
مطياف بصري للأشعة فوق البنفسجية	بصريات المحيط ، دنيدن ، فلوريدا	USB4000
مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية	شركة هيتاشي للعلوم عالية التقنية ، طوكيو ، اليابان	يو 2900
LED البنفسجي	لونغ هوي الالكترونية المحدودة ، دونغقوان ، الصين

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن