القياس الكمي للتعطيل البكتيري الناجم عن الضوء من خلال توليد أنواع الأكسجين التفاعلية

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: تشنغ ، سي ، وآخرون. تعطيل مسببات الأمراض عن طريق التحلل الضوئي للضوء المرئي للريبوفلافين -5′-الفوسفات. J. Vis. Exp. (2022).

في هذا الفيديو ، يتم تشعيع خليط تفاعل مخزن مؤقت يحتوي على L-methionine و nitro blue tetrazolium (NBT) و flavin mononucleotide (FMN) بالضوء البنفسجي للحث على إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). هذا يؤدي إلى تعطيل البكتيريا وتشكيل فورمازان يمكن اكتشافه طيفيا.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (O₂ • ⁻) في المكورات العنقودية الذهبية

تحضير عينات المكورات العنقودية الذهبية .
قم بتخفيف الكثافة البكتيرية للعينات بالماء المعقم إلى كثافة بصرية تبلغ 0.5 عند 600 نانومتر (OD (الكثافة البصرية) ₆₀₀ ، ~ 6 × 10⁶ CFU (وحدة تشكيل المستعمرة) / مل). انقل 0.5 مل من المزرعة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق وصب المادة الطافية للحصول على حبيبات خلية.
أضف 0.1093 جم من L-methionine و 0.1 جم من NBT (كلوريد رباعي الزولويوم الأزرق Nitro) و 25 مل من FMN (أحادي النوكليوتيد فلافين) (400 أو 240 أو 120 ميكرومتر) إلى 75 مل من PB (مخزن الفوسفات العازل). لكل 1 مل من المادة المتفاعلة المطبقة ، فإن التركيزات النهائية ل FMN والميثيونين و NBT هي 100 (60 أو 30) × ^10-6 م و 7.3 × ^10-3 م و 1.2 × ^10-3 م ، على التوالي.
أضف 1 مل من كل محلول متفاعل (أي بتركيزات متفاوتة من FMN) إلى كريات الخلية التي تم الحصول عليها. قم بإشعاع المحاليل بالضوء البنفسجي عند 10 واط / م² لمدة 10 دقائق.
قم بالطرد المركزي للخليط عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق وصبب. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لاستخراج NBT المخفض. اكتشف الأنواع O₂•⁻ المنتجة من الامتصاص عند 560 نانومتر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
ثنائي ميثيل سلفوكسيد	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري	190186
ميزان حرارة الأشعة تحت الحمراء	شركة رايتيك سانتا كروز ، كاليفورنيا	ميتاتريدر 4
مرق رطل	شركة ديفكو ، نيوجيرسي
لام-ميثيونين	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري	1.05707
NBT (كلوريد النيترو الأزرق رباعي الزوليم)	Bio Basic، Inc. ماركهام ، أونتاريو ، كندا
مزود الطاقة	شركة الصين للتكنولوجيا ، مدينة تايبيه الجديدة ، تايوان	YP30-3-2
ريبوفلافين 5 فوسفات	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري	ريفي 7774
عداد الطاقة الشمسية	شركة Tenmars للإلكترونيات ، تايبيه ، تايوان	TM-207
المكورات العنقودية الذهبية subsp. aureus	مركز جمع وبحوث الموارد الحيوية (BCRC) ، سينشو ، تايوان	10451
مطياف بصري للأشعة فوق البنفسجية	بصريات المحيط ، دنيدن ، فلوريدا	USB4000
مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية	شركة هيتاشي للعلوم عالية التقنية ، طوكيو ، اليابان	يو 2900
LED البنفسجي	لونغ هوي الالكترونية المحدودة ، دونغقوان ، الصين

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission