تحديد الفعالية المضادة للبكتيريا لشريط بوليمري محمل بالمضادات الحيوية

الملخص

المصدر: Sekar، A.، et al. ، طريقة جديدة لتحديد النشاط الطولي المضاد للبكتيريا للمواد المملوءة بالأدوية. J. Vis. خبرة. (2023)

يوضح هذا الفيديو مقايسا قائما على اللمعان لتقييم الفعالية المضادة للبكتيريا لشريط بوليمري محمل بالمضادات الحيوية عن طريق تحديد التلميع الذي يحركه ATP ، والذي ينخفض في المزارع البكتيرية المعرضة للمضاد الحيوي.

البروتوكول

إعداد دراسة النشاط المضاد للبكتيريا المعتمد على الوقت

1. قم بزراعة البكتيريا طوال الليل في 1 مل من مرق TSB (مرق الصويا التريبتيك).
2. قم بتخفيف المعلق البكتيري المزروع طوال الليل إلى 10⁵ CFU / مل في MHB المعقم (مرق مولر-هينتون) ، وتحقق من العدد الجراثيري القابل للحياة باستخدام وحدات اللمعان قبل بدء التجربة.
3. ضع شرائط UHMWPE البكر (البولي إيثيلين ذو الوزن الجزيئي الفائق) وشرائط UHMWPE المحملة بالأدوية (3 مم × 5 مم × 10 مم) داخل حقنة 3 مل.
4. اسحب MHB الذي يحتوي على 10⁵ CFU / مل في المحقنة من خلال الإبرة المرفقة حتى علامة 1.5 مل ، وهو ما يعادل 1.35 مل من MHB (الشكل 1: الخطوة 1).
5. ضع إعداد المحقنة في حاضنة اهتزاز (100 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية حتى النقاط الزمنية المشار إليها: 6 ساعات ، اليوم 1 ، اليوم 2 ، اليوم 3 ، اليوم 4 ، اليوم 5 ، اليوم 6 ، واليوم 7 (الشكل 1: الخطوة 2).
6. في كل نقطة زمنية محددة ، أخرج إعداد المحقنة ، وقم بإجراء فحص قابلية الجدوى الميكروبية في الوقت الفعلي على 100 ميكرولتر من التعليق البكتيري (الشكل 1: الخطوة 3-4).
   1. قم بإجراء الفحص القائم على اللمعان باستخدام ألواح بيضاء غير شفافة ذات قاع 96 بئرا.
   2. امزج 100 ميكرولتر من المعلقات البكتيرية المخففة مع 100 ميكرولتر من كاشف الفحص.
   3. ضع غطاءا مغطى بورق الألمنيوم فوق الطبق المحضر المكون من 96 بئرا ، واحتضنه لمدة 5 دقائق عند 100 دورة في الدقيقة.
   4. قم بقياس اللمعان على الفور باستخدام قارئ microplate باستخدام الإعدادات التالية في برنامج Gen5 3.11.
      1. انقر فوق جديد لإعداد بروتوكول في نافذة إدارة المهام .
      2. حدد كوستار 96 أبيض معتم في القائمة المنسدلة لنوع اللوحة.
      3. انقر فوق القراءة ضمن قائمة تحديد الخطوات > الإجراءات .
      4. انقر فوق Luminescence داخل نافذة طريقة القراءة . احتفظ بخيارات الألياف الطرفية/الحركية والإضاءة المحددة ضمن نوع القراءة ونوع البصريات، على التوالي. انقر فوق موافق.
      5. احتفظ بإعدادات <الافتراضية> في نافذة خطوة القراءة (الكسب = 135؛ وقت التكامل = 1 ثانية؛ ارتفاع القراءة = 4.5 مم). انقر فوق موافق.
      6. تظهر نافذة تخطيط اللوحة جاهزة للتشغيل. حدد مربع استخدام الغطاء في نافذة لوحة التحميل ، وانقر فوق موافق.
      7. ضع لوحة 96 بئرا في الماكينة لقراءة قيم اللمعان.
7. تحديد عدد البكتيريا القابلة للحياة ل 6 ح, يوم 1, اليوم 2, اليوم 3, واليوم 7 نقاط زمنية. حدد CFU (وحدات تشكيل المستعمرة) / مل من وحدات اللمعان باستخدام المنحنى القياسي المقابل.
8. تحقق من عدم وجود بكتيريا قابلة للحياة في العينات التي أظهرت قيم تلألؤ أقل من حد الاكتشاف عن طريق تنفيذ طريقة لوحة الانتشار على ألواح TSA (Tryptic soy agar) والاحتضان عند 35 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تحقق من وجود مستعمرات في اليوم التالي.
9. قم بالطرد المركزي للتعليق البكتيري المتبقي عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق ، واستنشاق الوسائط المستهلكة برفق. بالنسبة للأنابيب التي لا يتم فيها ملاحظة الكريات بصريا بسبب النشاط المضاد للبكتيريا للأدوية, اترك 100 ميكرولتر في الأنبوب لضمان عدم إزعاج الحبيبات غير المرئية (الشكل 1: الخطوة 5).
10. أعد تعليق البكتيريا المحببة في MHB الطازج ، واسحب المعلق البكتيري إلى نفس إعداد المحقنة من خلال الإبرة المرفقة (الشكل 1: الخطوة 6).

النتائج

الشكل 1: تمثيل تخطيطي للإعداد التجريبي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ATCC 12600	مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية
مقايسة جدوى الخلايا الميكروبية BacTiter-Glo	شركة بروميغا ، الولايات المتحدة الأمريكية	جي 8231
مرق الصويا BD Bacto Tryptic (فول الصويا والكازين Digest Medium)	بيكتون ديكنسون ، الولايات المتحدة الأمريكية	211825 دينار بحريني	تم شراؤها من فيشر العلمية ، الولايات المتحدة الأمريكية
حقنة BD Luer-Lok معقمة ، تستخدم مرة واحدة ، 3 مل	BD, الولايات المتحدة الأمريكية	309657
إبرة دينار بحريني 5/8 بوصة. استخدام واحد ، معقم ، 25 جرام	BD, الولايات المتحدة الأمريكية	305122
وسائط الثقافة المجففة BD BBL: مرق مولر هينتون الثاني (معدل الكاتيون)	بيكتون ديكنسون ، الولايات المتحدة الأمريكية	ب12322	تم شراؤها من فيشر العلمية ، الولايات المتحدة الأمريكية
BD Difco Dedryated ثقافة الإعلام: أجار الصويا التربتيك (فول الصويا والكازين دايجست أجار)	بيكتون ديكنسون ، الولايات المتحدة الأمريكية	DF0369-17-6	تم شراؤها من فيشر العلمية ، الولايات المتحدة الأمريكية
جنتاميسين كبريتات	شركة فوجيان فوكانغ للأدوية ، فوتشو ، الصين
حاضنة اهتزاز LSE على منضدة	كورنينج ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية
قارئ اللوحة (Synergy H1	بيوتيك، فاتو، الولايات المتحدة الأمريكية
شاكر إنوفا 2100	نيو برونزويك العلمي ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية
UHMWPE	GUR1020 ، سيلانيز ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية
فانكومايسين هيدروكلوريد	Fagron ، هولندا	804148