الزخرفة الدقيقة والتتبع القائم على التألق لنمو البكتيريا أحادية الخلية

الملخص

المصدر: Pioli، R.، et al.، Patterning of Microorganisms والجسيمات الدقيقة من خلال التجميع المتسلسل بمساعدة الشعيرات الدموية. J. Vis. خبرة. (2021)

يوضح هذا الفيديو طريقة التقاط خلايا الإشريكية القولونية المفردة الموسومة بالفلورسنت (E. coli) في مصائد الموائع الدقيقة باستخدام تعليق خال من الكربون وتدفق متحكم فيه ، متبوعا بإضافة المغذيات لتحفيز النمو والتصوير الفلوري للمستعمرات الدقيقة.

البروتوكول

1. الزخرفة البكتيرية

1. قبل يوم واحد من التجربة ، قم بزيادة عدد من الإشريكية القولونية (سلالة MG1655 prpsM-GFP). قم بتلقيح المزرعة مباشرة من المرق المجمد وتنمو طوال الليل لمدة 20 ساعة في وسط مرق ليزوجين (LB) في حاضنة شاكر عند 37 درجة مئوية. أضف 50 ميكروغرام / مل من الكاناميسين للخلايا للاحتفاظ ببلازميد prpsM-GFP (البروتين الفلوري الأخضر).
2. في يوم التجربة ، اضبط حاضنة الصندوق (الشكل 1 أ) على 37 درجة مئوية قبل عدة ساعات من التجربة لضمان درجة حرارة موحدة ومستقرة قبل البدء. بعد ذلك ، قم بإعداد مضخة الحقنة واللوحة الزجاجية الساخنة على مرحلة المجهر (الشكل 1 ب ، ج) ، وضبط درجة الحرارة على نفس درجة حرارة حاضنة الصندوق.
   ملاحظه: تضمن الحاضنة الصندوقية التي يتم فيها إحاطة النظام بأكمله ، بما في ذلك المجهر (الشكل 1E) ، الحفاظ على درجة حرارة موحدة وثابتة طوال التجربة بأكملها عند غسل القناة بالوسط.
3. قبل تسعين دقيقة من التجربة ، ضع رقاقة الموائع الدقيقة في وعاء مملوء بالإيثانول بنسبة 100٪ (EtOH) واغسل القناة بنسبة 100٪ EtOH لمدة 10 دقائق على الأقل. ضع رقاقة الموائع الدقيقة في مجفف فراغ وقم بإزالته لمدة 30 دقيقة على الأقل. استبدل EtOH بالماء المقطر وعالج الرقاقة بالمكنسة الكهربائية لمدة 30 دقيقة على الأقل. ضع رقاقة الموائع الدقيقة في الفرن على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة أي آثار للسائل المتبقي في القناة.
   ملاحظه: هذه الخطوة ضرورية لمنع تكوين الفقاعات في القناة عند غسلها بوسط الثقافة.
4. ماصة 1 مل من 3- (N-morpholino) حمض بروبانسولفونيك (MOPS) وسط (1x) في قارورة طرد مركزي وأضف 10 ميكرولتر من 0.132 M فوسفات البوتاسيوم (K₂HPO₄). أخرج المزرعة الليلية من الحاضنة 37 درجة مئوية وأدخل 100 ميكرولتر في قارورة أجهزة الطرد المركزي وقم بالطرد المركزي للثقافة عند 2,300 × جم لمدة دقيقتين. قم بإخراج المادة الطافية برفق من قوارير أجهزة الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط MOPS الطازج مع 0.015٪ حجم / حجم من Tween 20 و 0.01٪ v / v من فوسفات البوتاسيوم.
   ملاحظه: يتراوح التركيز النموذجي للتعليق البكتيري بين 0.015-0.15 فول ، مما يضمن تكوين منطقة تراكم ممتدة ومتحركة ويمنع تراكم الجسيمات على الركيزة. يقلل استبدال الوسط الليلي بوسط طازج من خطر إطلاق أغشية البكتيريا على القالب. يمنع عدم وجود مصدر كربون في الوسط الطازج الخلايا من النمو في التعليق أثناء زخرفة القالب. من الضروري تركيز 0.015٪ حجم / حجم من Tween 20 في التعليق حتى تقع زاوية التلامس مع السائل المتراجع على قالب PDMS ضمن النطاق الأمثل ، بين 30 و 60 درجة.
5. قم بتحميل المعلق البكتيري في حقنة سعة 1 مل وقم بتوصيل المحقنة بالشريحة من خلال أنابيب الموائع الدقيقة.
   1. لتأمين الاتصال بين المحقنة والأنبوب ، أدخل إبرة بقطر خارجي 0.6 مم مباشرة في الأنبوب. لتجنب تشتت أي تعليق متبقي في محيط المدخل عبر القناة ، قم بغسل الوسط الجديد من خلال الفتحة المستخدمة كمخرج أثناء عملية الزخرفة (الشكل 2A-III) ، بدلا من الفتحة المستخدمة كمدخل.
   2. قم بتركيب المحقنة على مضخة المحقنة وقم بحقن المعلق في رقاقة الموائع الدقيقة من خلال المدخل الموجود في الجزء العلوي من القناة حتى يغطي التعليق منطقة القالب بالفخاخ. ملاحظه: أثناء عملية حقن السائل ، يمكن للهواء أن يهرب من خلال مخرج يقع في نهاية مجرى النهر من القناة.
   3. اضبط مضخة المحقنة لسحب المعلق البكتيري (الشكل 2A-I) بمعدل تدفق 0.07-0.2 ميكرولتر / دقيقة ، والذي يتوافق في الهندسة الموصوفة مع سرعة انحسار الغضروف المفصلي من 80-100 ميكرومتر / دقيقة.
   4. راقب عملية الزخرفة عبر برنامج المجهر.
      ملاحظه: هنا ، تم استخدام تكبير 10x لمراقبة انحسار الغضروف المفصلي على القالب ، وتم استخدام تكبير 20x لمراقبة ترسب البكتيريا الفردية في الفخاخ المصنوعة من صنع الصنع.
6. بمجرد أن يتم نقش القالب بالخلايا (الشكل 2A-II) ، قم بزيادة معدل تدفق السحب لتفريغ قناة الموائع الدقيقة بسرعة وشطفها ب LB جديد تم تفريغه مسبقا لمدة 30 دقيقة على الأقل وتم تسخينه مسبقا عند 30 درجة مئوية.
7. اضبط مضخة المحقنة على معدل تدفق 2 ميكرولتر / دقيقة لغسل القناة برفق. بمجرد ملء القناة ، قم بزيادة معدل التدفق (15 ميكرولتر / دقيقة) وفقا للاحتياجات التجريبية المحددة.
8. احصل على صور للبكتيريا النامية عند التكبير المطلوب والفاصل الزمني المطلوب.

النتائج

الشكل 1: تخطيطي لمنصة التجميع المتسلسل بمساعدة الشعيرات الدموية في قناة الموائع الدقيقة. (أ) حاضنة الصندوق. تحافظ حاضنة الصندوق على درجة حرارة موحدة وثابتة (هنا ، 30 درجة مئوية) داخل قناة الموائع الدقيقة. (ب) حقنة محملة بتعليق سائل. يتم التح...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حقنة 10 مل من دينار بحريني (Luer-Lock)	دينار بحريني	300912	يستخدم لطرد مرق Lysogeny الطازج في قناة الموائع الدقيقة
حاضنة صندوق	خدمات تصوير الحياة		تستخدم لضمان درجة حرارة موحدة وثابتة في القناة
الطرد المركزي	إيبندورف	5424ص	تستخدم لاستبدال الوسائط الليلية بوسائط جديدة
قارورة الطرد المركزي	إيبندورف	30120086	1.5 مل
قاعدة سيتوني 120	شركة سيتوني المحدودة		مضخة حقنة
وحدة التحكم H401-T	أوكولاب		وحدة تحكم في اللوحة الزجاجية المسخنة
H601-نيكون-TS2R-زجاج	أوكولاب		صفيحة زجاجية ساخنة
محاقن الأنسولين ، U 100 ، مع لور	كودان الطبية APS	CODA621640	حقنة 1 مل تستخدم لسحب التعليق السائل أثناء عملية الزخرفة
مرق LB ، ميلر (لوريا بيرتاني)	فيشر العلمية	244610	مرق ليسوجين يتدفق في قناة الموائع الدقيقة
أنابيب نقل Masterflex	ماسترفليكس	الرقم HV-06419-05	0.020 '' معرف ، 0.06 '' OD
المماسح (10x)	تكنوفا	م 2101	مخفف عشرة أضعاف بالماء مليكيو ويستخدم لاستبدال الوسط بين عشية وضحاها
نيكون اكليبس Ti2	آلات نيكون		مجهر
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة	سيجما ألدريتش	ص 3786	تمت الإضافة إلى MOPS 1x
المراهقين 20	سيجما ألدريتش	ص 1379	تستخدم لضمان انحسار زاوية التلامس المثلى أثناء عملية الزخرفة