مثبطات فحص البيروفوسفاتيز المرتبط بالغشاء البكتيري باستخدام مقايسة الألوان

الملخص

المصدر: Vidilaseris, K., et al. فحص مثبطات البيروفوسفاتيز المرتبطة بالغشاء Thermotoga maritima . J. Vis. خبرة. (2019)

يوضح هذا الفيديو مقايسة لونية لفحص مثبطات البيروفوسفاتيز المرتبط بالغشاء البكتيري (mPPase) عن طريق تحديد إطلاق أورثوفوسفات. تتيح هذه الطريقة تحديد المركبات التي تثبط mPPase من Thermotoga maritima ، وهو هدف محتمل لمضادات الميكروبات.

البروتوكول

1. الكواشف لإعداد الفحص

1. تحضير محلول الزرنيخ والسترات.
   1. تزن 5 جم من زرنيخ الصوديوم و 5 جم من ثنائي هيدرات سترات ثلاثي الصوديوم.
      أنذر: زرنيخ الصوديوم سام. وبالتالي استخدام معدات الحماية المناسبة والتعامل معها بعناية خاصة. كإجراء احترازي ، لا تتعامل معه قبل قراءة وفهم جميع احتياطات السلامة اللازمة. مقبض فقط في غطاء الدخان حتى لا تستنشق الغبار / أبخرة المركب أو محاليل (محالول). في حالة الاستنشاق ، انتقل إلى الهواء النقي واحصل على العناية الطبية. ارتد نظارات واقية للسلامة الكيميائية وقفازات واقية وملابس مناسبة لتجنب الابتلاع وملامسة العين / الجلد. في حالة الابتلاع ، اتصل على الفور بمركز السموم أو الطبيب / الطبيب. إذا لامس الجلد أو في العين (العين) ، اغسلها بالكثير من الماء واحصل على رعاية طبية.
   2. تذوب في 100 مل من الماء.
   3. أضف 5 مل من حمض الخليك الجليدي ، واخلطه ، وأضف الماء إلى 250 مل.
   4. يحفظ في درجة حرارة الغرفة ، محميا من الضوء.
      ملاحظه: الحل مستقر لأكثر من عام.
2. تحضير الحل أ والحل ب.
   1. بالنسبة للمحلول أ ، أضف 10 مل من 0.5 م حمض الهيدروكلوريك المثلج إلى 0.3 جم من حمض الأسكوربيك. قم بإذابة حمض الأسكوربيك عن طريق الدوامة.
   2. بالنسبة للمحلول B ، أضف 1 مل من الماء المثلج إلى 70 مجم من رباعي هيدرات الأمونيوم والدوامة حتى يذوب.
      ملاحظه: قم بتخزين كلا المحلولين على الثلج حتى الاستخدام. من أجل اتساق نتيجة الفحص ، يمكن تخزين كلا المحلولين على الجليد لمدة أسبوع واحد كحد أقصى.
3. قم بإعداد معيار الفوسفات (Pi) بتركيز 0 ميكرومتر و 62.5 ميكرومتر و 250 ميكرومتر و 500 ميكرومتر للمعايرة.
   1. أضف 0 ميكرولتر و 25 ميكرولتر و 50 ميكرولتر و 100 ميكرولتر من 5 ملي مولار Na₂HPO₄ (فوسفات ثنائي الصوديوم) ثنائي هيدرات إلى أربعة أنابيب دقيقة تحتوي على 370 ميكرولتر من خليط التفاعل.
   2. قم بتعبئة ما يصل إلى 1 مل بالماء.

2. مقايسة النشاط للوحة واحدة 96 بئرا

ملاحظه: انظر الشكل 1 للحصول على سير العمل التخطيطي للمقايسة.

1. أضف 1 مل من المحلول B إلى 10 مل من المحلول A ، واخلطه عن طريق الدوامة ، وقم بتخزين المحلول على الثلج.
   ملاحظه: يجب أن يكون هذا المحلول شفافا وأصفر. احتفظ بالمحلول A + B على الثلج لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. ومع ذلك ، استخدم المحلول في غضون 3 ساعات لأنه سيفسد بعد التخزين طويل الأجل.
2. أضف 40 ميكرولتر من 0 ميكرومتر و 62.5 ميكرومتر و 250 ميكرومتر و 500 ميكرومتر Pi قياسيا إلى شرائط الأنبوب في ثلاث نسخ باستخدام ماصة متعددة القنوات.
   ملاحظه: سيتم استخدام خليط التفاعل بدون إضافة Pi كفراغ.
3. أضف 25 ميكرولتر من المحلول المركب إلى شرائط الأنبوب باستخدام ماصة متعددة القنوات.
   ملاحظه: يحتوي كل مركب على ثلاثة تركيزات مختلفة في ثلاث نسخ وهو ما يكفي للتقدير الأولي لنصف التركيز المثبط الأقصى (IC50). لتحديد IC50 أكثر دقة ، يمكن استخدام ثمانية تركيزات مختلفة من المركبات. بالنسبة للإنزيم غير المثبط ، يتم استبدال المحلول المركب بكمية متساوية من الماء. كضوابط إيجابية تم استخدام 2.5 ميكرومتر و 25 ميكرومتر و 250 ميكرومتر من ملح الصوديوم إيميدوديفوسفات (IDP).
4. أضف 15 ميكرولتر من خليط محلول mPPase (بيروفوسفاتيز المرتبط بالغشاء) إلى شرائط الأنبوب (باستثناء الأنابيب التي تحتوي على معيار Pi) باستخدام ماصة متعددة القنوات.
5. أغلق شرائط الأنبوب بورقة مانعة للتسرب لاصقة. قطع ورقة الختم لفصل كل شريط أنبوب.
6. احتضان العينات مسبقا لمدة 5 دقائق عند 71 درجة مئوية. ضع العينات على كتلة التسخين بفاصل زمني 20 ثانية بين كل شريط لتقليل استهلاك الوقت خلال الخطوات اللاحقة.
7. لكل شريط ، افتح الختم اللاصق. أضف 10 ميكرولتر من بيروفوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة 2 ملي مولار باستخدام ماصة متعددة القنوات واخلطها عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل لمدة 5×. أغلق شريط الأنبوب مرة أخرى باستخدام نفس الختم.
   ملاحظه: قد يكون من الصعب إنجاز هذه الخطوة في البداية في 20 ثانية. ومع ذلك ، سيصبح الأمر أسهل بعد بعض المقايسات.
8. احتضان عند 71 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
9. ضع العينات على جهاز التبريد بفاصل زمني 20 ثانية بين كل شريط. اتركهم يبردوا لمدة 10 دقائق ولكن قم بالطرد المركزي لكل شريط لفترة وجيزة بعد 5 دقائق من التبريد ، لصب قطرات الماء تحت ورقة الختم ، ثم أعده إلى جهاز التبريد وقم بإزالة الختم.
   ملاحظه: يمكن صنع جهاز التبريد ببساطة عن طريق وضع لوحة PCR (تفاعل البوليميراز المتسلسل) ذات 96 بئرا على طبق بتري من البوليسترين (مقاس 150 مم × 15 مم) مملوء بالماء ومجمد لمدة ساعة واحدة على الأقل. يجب إخراج الجهاز من الفريزر قبل حوالي 5 دقائق من بدء الفحص. لا تقم بإخراج جهاز التبريد قبل تبريد العينة مباشرة لأنه سيجمد خليط التفاعل ويعيق تطور اللون.
10. بعد 10 دقائق من التبريد ، أضف 60 ميكرولتر من المحلول A + B ، واخلطه عن طريق سحب العاصة لأعلى ولأسفل لمدة 5× ، واحتفظ بشرائط الأنبوب على جهاز التبريد لمدة 10 دقائق.
11. أضف 90 ميكرولتر من محلول الزرنيخ والسترات واحتفظ به في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل للحصول على لون أزرق مستقر.
    أنذر: نظرا لسميته ، يجب التعامل مع جميع المحاليل التي تحتوي على زرنيخ الصوديوم بعناية فائقة في جميع الأوقات. وبالتالي ، يجب أن تتم إضافة محلول الزرنيخ والسترات في غطاء الدخان.
12. قم بتوزيع 180 ميكرولتر من كل خليط تفاعل في صفيحة دقيقة من البوليسترين ب 96 بئرا.
13. قم بقياس امتصاص كل بئر عند 860 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي الدقيق.

النتائج

الشكل 1: سير عمل تخطيطي لمقايسة تثبيط TmPPase في شكل لوحة 96 بئرا. يوضح الترقيم الأحمر خطوات الفحص وفقا للبروتوكول ، وتظهر الأسهم الزرقاء ترتيب الفاصل الزمني. TmPPase: mPPase من البكتيريا المحبة للحرارة Thermotoga maritima.

المواد