تصور بروتينات الإنبات في الغشاء الداخلي للجراثيم البكتيرية

الملخص

المصدر: Wen، J.، Pasman، et al.، تصور الجراثيم والغشاء الداخلي في جراثيم العصيات الرقيقة . J. Vis. خبرة. (2019)

يوضح هذا الفيديو استخدام الفحص المجهري للإضاءة المنظمة للحصول على صور مضان ثلاثية الأبعاد تكشف عن تنظيم بروتينات الإنبات داخل الأبواغ البكتيرية.

البروتوكول

1. تصوير بروتين الإنبات (التوقيت: 1 ساعة)
   1. التقط صور الإرسال والمضان للجراثيم بالإضافة إلى مزيج من الكرات المجهرية الفلورية المعدلة بالكربوكسيل باللونين الأحمر والأصفر والأخضر على مجهر إضاءة منظم (انظر جدول المواد) مزود بهدف زيتي 100x (الفتحة العددية = 1.49) ، وكاميرا CCD (جهاز مقترن بالشحن) ، وبرنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد)). قم بإنشاء جميع الصور في درجة حرارة الغرفة دون إزعاج الإضاءة المحيطة. تأكد دائما من تنظيف هدف 100x والشريحة بنسبة 75٪ إيثانول قبل التصوير.
   2. ركز على الكريات المجهرية الفلورية 100 نانومتر (قطرها) وقم بتحسين وظيفة انتشار النقاط (psf) عن طريق ضبط حلقة التصحيح على هدف 100x حتى يتم الحصول على psf متماثل ، وبالتالي تقليل عدم وضوح الصورة. psf هي استجابة النبضات أو استجابة نظام التصوير لمصدر نقطة أو كائن نقطي.
   3. حدد مجال رؤية يحتوي على حوالي 10 مجهرات فلورية مستديرة. قم بتطبيق ضبط تركيز صريف لكل من الأطوال الموجية للإثارة 561 نانومتر و 488 نانومتر كدليل لبرنامج تحليل الصور.
   4. ركز الجراثيم بضوء الإرسال والتقط صورة ضوء الإرسال في الوضع المتوسط 16× مع تعريضات ضوئية تبلغ 200 مللي ثانية لكل صورة.
   5. التقاط صور الفلورسنت الخام 3D-SIM من الجراثيم مع وضع الإضاءة "3D-SIM", إعدادات الكاميرا لوضع القراءة مضاعفة الإلكترون (EM) كسب 10 ميغاهيرتز في 14 بت, وكسب EM في 175. قم بإثارة مسبار FM4-64 في جراثيم PS4150 بضوء ليزر 561 نانومتر بقوة ليزر 20٪ ، ووقت إضاءة يبلغ 400 مللي ثانية.
   6. قم بإثارة GerKB-mCherry و GerD-GFP في جراثيم KGB80 ، على التوالي ، بضوء ليزر 561 نانومتر بقوة ليزر 30٪ لمدة 1 ثانية ، وضوء ليزر 488 نانومتر بقوة ليزر 60٪ لمدة 3 ثوان. إعدادات Z-Stack في الوضع من أعلى إلى أسفل ، 0.2 ميكرومتر / خطوة.
      ملاحظه: تم تطبيق معلمات الليزر هذه لضمان قيمة سطوع قصوى تبلغ حوالي 4,000 لنافذة الرسم البياني.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
شرائح زجاجية مجففة بالهواء	Menzel Gläser	630-2870
APO TIRF N20R8 100× هدف النفط (NA = 1.49)
العصيات الرقيقة KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat ، gerD-gfp و)
العصيات الرقيقة PS4150 (PS832 ΔgerE :: spc ، ΔcotE :: tet)
FluoSpheres المجهرية المعدلة بالكربوكسيل	Invitrogen ، 0.1 ميكرومتر	إف 8803
FM4-64	ثيرمو فيشر العلمي	إف 34653
هيستودينز وسط تدرج الكثافة غير الأيونية	سيجما ألدريتش	د 2158
الصورة J
كاميرا iXON3 DU-897 X-6515 CCD	أندور تكنولوجي		https://imagej.net/Welcome
برنامج التصوير المجهري	نيكون ، اليابان	نيس عنصر AR 4.51.01
MilliQ مياه منزوعة المعادن فائقة النقاء	ميليبور	ميلي كيو IQ 7003
مجهر نيكون Eclipse Ti
أغطية دقيقة	بول مارينفيلد	117650
أنابيب الغطاء اللولبي 50 مل	ثيرمو فيشر العلمي		نوك TM