تعداء الأميبا من النوع البري عن طريق التثقيب الكهربائي مع دعم التغذية البكتيرية

الملخص

المصدر: Paschke, P., et al. الهندسة الوراثية لخلايا Dictyostelium discoideum على أساس الانتقاء والنمو على البكتيريا. J. فيس. إكسب. (2019).

يوضح هذا الفيديو إجراء إدخال البلازميد الذي يحمل جينا مستهدفا في خلايا الأميبا عن طريق التثقيب الكهربائي ، متبوعا بالتعافي في مكمل بكتيري لتمكين توصيل الجينات بكفاءة في الأميبا من النوع البري.

البروتوكول

1. إعداد خلايا Dictyostelium للتعداء
   1. قم بزراعة Klebsiella aerogenes لتلتقي في وسط SM (الحليب الخالي من الدسم) (وسط غني بالمغذيات) طوال الليل في RT (درجة حرارة الغرفة). يمكن تخزين الثقافات لمدة تصل إلى أسبوعين عند 4 درجات مئوية.
   2. أضف حوالي 400 ميكرولتر من هذا المعلق البكتيري على لوحة أجار SM (الببتون 10 جم / لتر ؛ مستخلص الخميرة 1 جم / لتر ؛ الجلوكوز 10 جم / لتر ؛ KH₂PO₄ 1.9 جم / لتر ؛ K₂HPO₄ × 3 H₂O ، 1.3 جم / لتر ؛ MgSO₄ اللامائي 0.49 جم / لتر ؛ 1.7٪ أجار) وانتشر بالتساوي. خذ حلقة معقمة وقم بالتلقيح بخلايا Dictyostelium . انشر الخلايا على حافة واحدة من اللوحة.
   3. احتضان اللوحة عند 22 درجة مئوية لمدة يومين لضمان مناطق نمو كبيرة بما فيه الكفاية للتعدي.
      ملاحظه: بالنسبة لسلالات Dictyostelium التي لا تصنع مناطق نمو كبيرة (على سبيل المثال ، Ax3 أو DH1 أو JH10) ، أو للمجربين عديمي الخبرة ، استخدم لوحات المقاصة بدلا من ذلك.
   4. خذ حلقة معقمة وتلقيح بخلايا Dictyostelium (حوالي 2-4 × 10⁵ خلايا). انقل الخلايا إلى 800 ميكرولتر من تعليق K. aerogenes الكثيف في SM. امزج الخلايا عن طريق سحب العاصة لأعلى ولأسفل.
   5. انقل 400 ميكرولتر و 200 ميكرولتر و 100 ميكرولتر و 50 ميكرولتر على ألواح أجار SM جديدة. أضف إلى كل لوحة 400 ميكرولتر من تعليق SM K. aerogenes الإضافي ، ينتشر بالتساوي ، ويجاف.
   6. احتضان الألواح عند 22 درجة مئوية لمدة يومين تقريبا حتى تصبح الألواح شفافة.
      ملاحظه: نظرا لمعدل نموها الأسرع ، تنتج البكتيريا في البداية عشبا متقاربا ، وتقوم الأميبات لاحقا "بإزاحة" صفيحة البكتيريا. يمكن أن يختلف الوقت اللازم لهذه العملية اعتمادا على خلفية الإجهاد وقدرة الخلايا الطافرة على النمو على البكتيريا.

2. تعداء خلايا Dictyostelium على أساس الانتقاء البكتيري

1. لتحضير الألواح مع K. aerogenes معلق ، أضف 10 مل من المخزن المؤقت SorMC الذي يحتوي على بكتيريا K. aerogenes إلى كثافة OD (الكثافة البصرية) ₆₀₀ = 2 (أضف 200 ميكرولتر من محلول مخزون OD₆₀₀ = 100 K. محلول مخزون الهواء المحضر لتركيز البكتيريا المطلوب) في طبق بتري معالج بزراعة الأنسجة مقاس 10 سم.
   ملاحظه: هذه اللوحة مطلوبة لاحقا لزراعة خلايا D. discoideum المنقولة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام صفيحة زراعة الأنسجة ذات 6 آبار. في حالة تعداء البلازميدات خارج الكروموسومات ، تكون لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار أكثر كفاءة في استخدام الموارد. استخدم 2 مل من K. aerogenes SorMC (OD₆₀₀ = 2) تعليق لكل بئر.
2. تحضير خلايا Dictyostelium
   1. باستخدام حلقة تلقيح يمكن التخلص منها بسعة 10 ميكرولتر ، قم بكشط الخلايا من مناطق النمو (حوالي 3 سم) من صفيحة الاستزراع (حافة المنطقة التي تم تطهيرها) أو لوحة المقاصة. انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من المخزن المؤقت H40 المثلج.
      ملاحظه: يعد توقيت حصاد الخلايا من ألواح التطهير أمرا بالغ الأهمية. ينتج عن الحصاد المبكر كمية قليلة جدا من الخلايا ، بينما يزيد الحصاد في وقت متأخر من خطر إنتاج الخلايا المطورة جزئيا.
   2. اغسل الخلايا عن طريق الدوران لأسفل لمدة دقيقتين عند 1,000 × جم أو الغزل السريع لمدة 2 ثانية عند 10,000 × جم. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت H40 إلى كثافة نهائية تبلغ 2-4 × 10⁷ خلايا / مل. حافظ على برودة الخلايا أثناء عملية التعداء بأكملها. استخدم ملاط الماء المثلج لضمان الاتصال المباشر للأنابيب والثلج.
3. التثقيب الكهربائي
   1. أضف 100 ميكرولتر من الخلايا إلى أنبوب يحتوي على 1-2 ميكروغرام من الحمض النووي (حمض الديوكسي ريبونوكلييك). تخلط بعناية عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
   2. انقل خليط الخلية / الحمض النووي إلى كوفيت التثقيب الكهربائي المبرد مسبقا (فجوة 2 مم).
   3. قم بنبض الخلايا باستخدام إعدادات الموجة المربعة التالية: 350 فولت ، 8 مللي ثانية ، 2 نبضة ، وفاصل نبض 1 ثانية.
      ملاحظه: لا تضيف أكثر من 2 ميكروغرام من الحمض النووي. كميات أعلى سامة للخلايا وتقلل من كفاءة تعديس. يجب ألا يتجاوز إجمالي حجم الحمض النووي المضاف 5 ميكرولتر.
   4. انقل الخلايا على الفور إلى طبق بتري 10 سم المعد مسبقا مع K. aerogenes SorMC والسماح للخلايا بالتعافي لمدة 5 ساعات.
      ملاحظه: افحص الخلايا الموجودة في طبق بتري تحت المجهر المقلوب. ستظهر الخلايا مستديرة مباشرة بعد التثقيب الكهربائي ولكنها ستعود إلى شكلها الأميبي بعد حوالي 30 دقيقة ، عندما يكون لديها الوقت الكافي للالتصاق بشكل صحيح بالسطح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أجهزة الطرد المركزي الدقيقة Eppendorf 5424/5424R	ثيرماسايفكتيفيك	05-400-002
أجهزة الطرد المركزي Eppendorf 5702R مع طراز A-4-38 الدوار	ثيرماسايفكتيفيك	12823252
خزانة السلامة Foruna - SCANLAF	لابوجين
BioPhotometer Plus	إيبندورف
سي ايل إس إم 710	زييس
أجار منقى	أوكسويد	LP0028
مرق SM	فورميديوم	SMB0102
2x مرق رطل	فورميديوم	LBD0102
حمض هيبس خال	سيجما ألدريتش / ميرك	391340 EMD
KH₂PO₄	VWR	ف/4800/53
Na₂HPO₄ 2H₂O	VWR	10028-24-7
MgCl₂ 6H₂O	سيجما ألدريتش / ميرك	5982 EMD
CaCl₂ 2H₂O	سيجما ألدريتش	442909
حمض الفوليك	سيجما ألدريتش	إف 7876
كوه	VWR	26668.263
100 × 20 مم نمط طبق زراعة الأنسجة ، معالجة زراعة الأنسجة	كورنينج إنكوربوريتد	353003
2 مم فجوة كهربائية cuvettes ، قطب طويل	جينفلو المحدودة	E6-0062
حلقة تلقيح 10 ميكرولتر ، أزرق 10 ميكرو لتر	ثيرماسايفكتيفيك	129399
موزع ، على شكل حرف L ، معقم	greiner bio-one	730190