إثراء البروتينات الدهنية البكتيرية باستخدام فصل مرحلة المنظفات غير الأيونية

الملخص

المصدر: Armbruster، K.M.، Meredith، T. C. إثراء البروتينات الدهنية البكتيرية وتحضير الببتيدات الدهنية الطرفية N للتحديد الهيكلي عن طريق قياس الطيف الكتلي. J. Vis. خبرة. (2018)

يوضح هذا الفيديو إثراء البروتينات الدهنية البكتيرية باستخدام منظف غير أيوني يخضع لفصل الطور عند الاحترار. من خلال التحولات المتسلسلة في درجات الحرارة وخطوات الطرد المركزي ، يتم تقسيم البروتينات الدهنية بشكل انتقائي إلى مرحلة المنظفات ، بينما تتم إزالة الملوثات غير البروتينية الدهنية. ثم يتم ترسيب البروتينات الدهنية المخصبة وغسلها وتعليقها للتطبيقات النهائية.

البروتوكول

1. إثراء البروتينات الدهنية بواسطة تقسيم المرحلة Triton X-114 (TX-114)

1. استكمل محللة البكتيريا بالفاعل بالسطح TX-114 إلى تركيز نهائي قدره 2٪ (حجم / حجم) عن طريق إضافة حجم متساو من 4٪ (حجم / حجم) خافض للتوتر السطحي في محلول ملحي مبرد من تريس / حمض الإيثيلين ديامين رباعي أسيتيك (TBSE) واحتضان على الجليد لمدة ساعة واحدة ، وخلطه عن طريق الانعكاس كل ~ 15 دقيقة.
   ملاحظه: عندما يتم تبريده ، سيكون المادة الطافية والخافضة للتوتر السطحي قابلة للامتزاج.
2. انقل الأنبوب إلى حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واحتضنه لمدة 10 دقائق للحث على فصل الطور. قم بالطرد المركزي للعينة عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحفاظ على الفصل ثنائي الطور.
3. قم بإزالة الماصة برفق من المرحلة المائية العلوية وتخلص منها. أضف TBSE المثلج إلى المرحلة السفلية للتوتر السطحي لإعادة ملء الأنبوب إلى حجمه الأصلي وقلبه للخلط. احتضن على الثلج لمدة 10 دقائق.
4. انقل الأنبوب إلى حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واحتضنه لمدة 10 دقائق للحث على فصل الطور ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. كرر الخطوات من 1.3 إلى 1.4 مرة أخرى ليصبح المجموع 3 فواصل. قم بإزالة المرحلة المائية العلوية وتخلص منها.
6. قم بإزالة حبيبات البروتينات المترسبة التي تشكلت أثناء عمليات الاستخراج (مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب) ، عن طريق إضافة 1 حجم من TBSE البارد المثلج إلى مرحلة الفاعل بالسطح. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية عند 16,000 × جم لمدة دقيقتين لحبيبات البروتين غير القابل للذوبان.
   ملاحظه: يجب أن تظل العينة مرحلة واحدة. في حالة حدوث فصل الطور ، أعد تبريد العينة وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى. تتكون الحبيبات بشكل عام من ملوثات غير البروتين الدهني ولكن يمكن الاحتفاظ بها لمزيد من التحليل.
7. انقل المادة الطافية على الفور إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 2.0 مل يحتوي على 1250 ميكرولتر من الأسيتون بنسبة 100٪. قم بإزالة الماصة لأعلى ولأسفل جيدا لغسل العينة من الحافة لأنها ستكون لزجة. تخلط عن طريق الانعكاس وتحتضن طوال الليل عند -20 درجة مئوية لترسيب البروتين.
8. قم بالطرد المركزي للعينة عند 16,000 × جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لحبيبات البروتينات الدهنية مع الانتباه إلى اتجاه الأنبوب. ستشكل البروتينات الدهنية طبقة بيضاء رقيقة على طول الجدار الخارجي للأنبوب.
9. اغسل الحبيبات مرتين مع 100٪ أسيتون. صب الأسيتون واترك العينة تجف في الهواء.
10. أضف 20-40 ميكرولتر من 10 ملي مولار Tris-hydrochloride أو درجة الحموضة 8.0 أو مخزن مؤقت عينة قياسي Laemmli SDS-PAGE وأعد تعليقه تماما عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل على الحائط باستخدام البروتينات الدهنية المترسبة. اكشط جانب الأنبوب بطرف الماصة لإخراج البروتينات الدهنية.
    ملاحظه: لن تذوب البروتينات الدهنية في المخزن المؤقت Tris بل تشكل معلقا.
    1. قم بتخزين البروتينات الدهنية في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

المواد