التنقية الانتقائية للبروتين البكتيري عن طريق كروماتوغرافيا التبادل الأيوني السالب

الملخص

المصدر: Kuo, T., et al. تنقية كروماتوجرافية سلبية من خطوة واحدة للبروتين المنشط للعدلات الملوية البوابية المفرط في التعبير عنها في الإشريكية القولونية في وضع الدفعات. J. Vis. خبرة. (2016)

يوضح الفيديو تقنية كروماتوغرافيا سلبية لتنقية البروتين المرتبط بالفوعة من محللة بكتيرية. باستخدام راتينج موجب الشحنة في محلول مخزن مؤقت ، يتم الاحتفاظ ببروتينات الخلية المضيفة بشكل انتقائي ، بينما يظل البروتين المستهدف شبه المحايد غير مرتبط ويتم جمعه في التدفق. تسمح هذه الطريقة بالفصل الفعال واستعادة البروتين المستهدف للتطبيقات النهائية.

البروتوكول

1. التعبير عن HP-NAP المؤتلف في الإشريكية القولونية (الإشريكية القولونية)

1. قم بإعداد البلازميد pET42a-NAP الذي يحتوي على تسلسل الحمض النووي للبروتين المنشط للعدلات هيليكوباكتر بيلوري (HP-NAP) من سلالة الملوية البوابية 26695 كما هو موضح سابقا. قم بإعداد البلازميدات التي تحتوي على تسلسل الحمض النووي ل HP-NAP مع طفرات النقطة المطلوبة.
2. قم بتحويل 10 نانوغرام من بلازميدات الحمض النووي المذكورة أعلاه إلى بكتريا قولونية BL21 (DE3) خلايا مختصة عن طريق الصدمة الحرارية لمدة 45 ثانية عند 42 درجة مئوية ، وقم بربط الخلايا على ألواح أجار مرق ليزوجيني (LB) تحتوي على 50 ميكروغرام / مل كانامايسين ، واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
3. قم بتلقيح المستعمرات المفردة في أنابيب فردية تحتوي على 5 مل من مرق LB مع 50 ميكروغرام / مل من الكانامايسين وزراعتها كمزارع مسبقة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة مع الاهتزاز عند 170 دورة في الدقيقة.
4. قم بتلقيح 2 مل من خلايا ما قبل الاستزراع المذكورة أعلاه في 200 مل من مرق LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل كانامايسين في قارورة سعة 1 لتر. احتضان قارورة المزرعة الملقحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين مع الاهتزاز عند 170 دورة في الدقيقة حتى يصل الامتصاص عند 600 نانومتر إلى حوالي 0.4-0.5 تم اكتشافه بواسطة مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية (UV / VIS).
5. أضف 80 ميكرولتر من 1 M من الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى المزرعة أعلاه إلى تركيز نهائي قدره 0.4 ملي مولار للحث على التعبير عن HP-NAP. احتضان المزرعة لمدة 3 ساعات حتى يصل الامتصاص عند 600 نانومتر إلى حوالي 1.6-1.7.
6. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 6,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة المادة الطافية. قم بتخزين حبيبات الخلية عند -70 درجة مئوية حتى التنقية.

2. تحضير جزء البروتين القابل للذوبان الذي يحتوي على HP-NAP

ملاحظه: يتم تنفيذ جميع الخطوات التالية عند 4 درجات مئوية.

1. أعد تعليق 50 مل من حبيبات الخلية المحضرة في خطوة البروتوكول 1.6 في 20 مل من 20 ملي Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 9.0 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم يحتوي على 0.13 ملي فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) ، 0.03 ملي مولار N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) ، و 0.03 ملي مولار N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) عند 4 درجات مئوية كما هو موضح سابقا.
2. قم بتعطيل الخلايا البكتيرية عن طريق تمرير المعلق البكتيري من خلال مجانس عالي الضغط يعمل في نطاق يتراوح من 15,000 إلى 20,000 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 7 مرات عند 4 درجات مئوية.
3. قم بالطرد المركزي للخلية المحللة عند 30,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة لفصل أجزاء البروتين القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان باستخدام جهاز طرد مركزي فائق. انقل المادة الطافية كجزء بروتين قابل للذوبان إلى دورق
4. قم بقياس تركيز البروتين في جزء البروتين القابل للذوبان بطريقة برادفورد باستخدام مجموعة تجارية مع ألبومين مصل البقر (BSA) كمعيار ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
5. أضف 177.6 ميكرولتر من 1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك إلى 20 مل من جزء البروتين القابل للذوبان الذي تم الحصول عليه من خطوة البروتوكول 2.3 لضبط قيمة الأس الهيدروجيني من الرقم الهيدروجيني 9.0 إلى الرقم الهيدروجيني 8.0.
6. أضف 20 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم إلى محلول البروتين أعلاه لجعل تركيز البروتين النهائي 0.5 مجم / مل.

3. تنقية HP-NAP المؤتلف من الإشريكية القولونية عن طريق كروماتوغرافيا دفعة الوضع السلبي مع راتنجات التبادل الأيوني DEAE

1. تحضير 15 مل من راتنجات ثنائي إيثيل أمينو إيثيل (DEAE).
   1. قم بوزن 0.6 جرام من مسحوق جاف من راتنجات DEAE وقم بتعليقه في 30 مل من 20 ملي Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم واحد على الأقل.
   2. قم بالطرد المركزي للراتنج عند 10,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 1 دقيقة.
   3. قم بإزالة الطافق وتخلص منه.
   4. أضف 15 مل من 20 ملي Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم.
   5. كرر خطوات البروتوكول من 3.1.2 إلى 3.1.4 أربع مرات أخرى.
   6. قم بتخزين 15 مل من الراتنج المستقر (50٪ ملاط في 30 مل من المخزن المؤقت Tris) عند 4 درجات مئوية للاستخدام اللاحق.
      ملاحظه: يتم تنفيذ جميع الخطوات التالية عند 4 درجات مئوية.
2. أضف 45 مل من البروتينات القابلة للذوبان المحضرة في خطوة البروتوكول 2.6 إلى 15 مل من الراتنج وحرك ملاط البروتين / الراتنج باستخدام محرك مغناطيسي عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.
3. صب ملاط البروتين / الراتنج في عمود بلاستيكي أو زجاجي مزود بمحبس. دع الراتنج يستقر تحت الجاذبية.
4. افتح محبس للسماح لمحلول البروتين بالمرور عبر العمود عن طريق تدفق الجاذبية حتى يكون مستوى السائل في العمود أعلى من الراتنج مباشرة. اجمع التدفق باعتباره الكسر غير المرتبط ، والذي يحتوي على HP-NAP المنقى.
5. أضف 15 مل من 20 ملي Tris-HCl المثلج ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم في العمود.
6. افتح محبس للسماح لمخزن الغسيل بالمرور عبر العمود عن طريق تدفق الجاذبية حتى يكون مستوى السائل في العمود أعلى من الراتنج مباشرة. اجمع التدفق من خلال كجزء الغسيل.
7. كرر خطوات البروتوكول من 3.5 إلى 3.6 أربع مرات أخرى لتجميع كسور الغسيل الإضافية.

المواد