إجراء لتنقية بروتين الموسومة بالبولي هيستيدين من Streptococcus mutans

الملخص

المصدر: Murata، T.، et al. تنقية بروتين عالي الكتلة الجزيئية في Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو إجراء خطوة بخطوة لتنقية بروتين يحمل علامة polyhistidine يفرز من Streptococcus mutans.

البروتوكول

1. تركيز البروتينات من المزرعة الطافية عن طريق ترسيب كبريتات الأمونيوم.
   ملاحظه: استخرج من أجسام الخلايا إذا كان البروتين المستهدف داخل الخلايا.
   1. قم بالطرد المركزي للثقافة البكتيرية (Streptococcus mutans) معلق لمدة 20 دقيقة عند 10,000 × جم عند 4 درجات مئوية.
   2. أضف 1,122 جم من كبريتات الأمونيوم إلى 2 لتر من المادة الطافية (تشبع 80٪) مع التحريك القوي باستخدام محرك مغناطيسي. اترك الراسب يتشكل لمدة 4 ساعات أو أكثر عند 4 درجات مئوية مع التحريك.
      ملاحظه: يمكن أن يستمر تكوين الراسب بين عشية وضحاها.
   3. قم بالطرد المركزي للمحلول المترسب بكبريتات الأمونيوم عند 15,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. صب المادة الطافية.
   4. اجمع الراسب بملعقة وانقله إلى دورق زجاجي سعة 200 مل. أعد تعليق الكريات في 35 مل من المخزن المؤقت للربط (50 ملي هيدروكسيد الصوديوم₂PO₄ ، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي إيميدازول ، درجة الحموضة 8.0).
   5. قم بإزالة التعليق مقابل 2,500 مل من المخزن المؤقت للربط باستخدام أنبوب غسيل الكلى السليلوز المتجدد ، عند 4 درجات مئوية ، مع التحريك. استبدل محلول غسيل الكلى بعد ساعتين واستمر في غسيل الكلى طوال الليل.
   6. استبدل محلول غسيل الكلى مرة أخرى. استمر في تحليل غسيل الكلى لمدة 2 ساعة إضافية.
2. قم بالطرد المركزي للتعليق المسال عند 20,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح غشائي باستخدام معدات ترشيح الشفط. انقل المرشح إلى قارورة مقاس 75 سم² .
3. تجزئة الجلوكوزيل ترانسفيراز-SI (GTF-SI) الموسومة بالبولي هيستيدين من المعلق المفلتر بواسطة كروماتوغرافيا تقارب المعادن المثبتة (IMAC).
   1. انقل 2 مل من ملاط راتنج IMAC المشحون بالنيكل (حوالي 1 مل من الراتنج) إلى عمود كروماتوغرافي يتم تركيب مخرجه على أنبوب سيليكون. قم بإزالة محلول التخزين عن طريق تدفق الجاذبية.
      أنذر: لا تدع الراتنج يجف في جميع أنحاء IMAC.
   2. أضف 3 مل من الماء المقطر إلى العمود لغسل الراتنج. أضف 5 مل من المخزن المؤقت للربط لموازنة الراتنج.
   3. أغلق التدفق باستخدام ديك قرصة هوفمان. أضف 5 مل من المعلق المفلتر من الخطوة 2 لعمل الملاط.
   4. أضف كل الملاط إلى التعليق المفلتر المتبقي. حرك الخليط برفق لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   5. قم بتحميل الخليط مرة أخرى على العمود. قم بإزالة التعليق عن طريق تدفق الجاذبية. اغسل راتنج IMAC ب 20 مل من المخزن المؤقت للربط.
      ملاحظه: اضبط معدل التدفق إلى حوالي 2 مل / دقيقة باستخدام قضيب قرصة هوفمان طوال IMAC اللاحق.
   6. قم بإزالة GTF-SI المؤتلف ب 20 مل من المخزن المؤقت للشطف (50 ملي مولار هيدروكسيد الصوديوم₂PO₄ ، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 500 ملي إيميدازول ، درجة الحموضة 8.0).
      ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يجب تخزين الأنبوب عند 4 درجات مئوية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
وحدة الترشيح الفائق بالطرد المركزي	سارتوريوس	في 2032	استبدال المخزن المؤقت وتركيز البروتين
الطرد المركزي	كوبوتا	7780ثان
عمود كروماتوغرافي	بيو راد	7321010	بالنسبة إلى IMAC
غشاء غسيل الكلى المشبك	ماركة فيشر	21-153-100
أنابيب غسيل الكلى	كواحد	2-316-06
إيميدازول	واكو	095-00015	المخزن المؤقت للربط وإعداد المخزن المؤقت للشطف
حاضنه	نيبون للأدوات الطبية والكيميائية	LH-100-RDS	ضبط درجة الحرارة: 37 درجة مئوية
أجهزة الطرد المركزي الدقيقة	كوبوتا	3740
كلوريد الصوديم	واكو	191-01665	تحضير المخزن المؤقت للربط ومخزن السحب
ثنائي هيدروجين فوسفات الصوديوم ثنائي الهيدرات	واكو	192-02815	تحضير المخزن المؤقت للربط ومخزن السحب
هيدروكسيد الصوديوم	واكو	198-13765	تحضير المخزن المؤقت للربط ومخزن السحب
كبريتات الأمونيوم	واكو	015-06737	ترسيب كبريتات الأمونيوم
راتنج Ni-charged	بيو راد	1560133	بالنسبة إلى IMAC
مرشح الغشاء	ميرك ميليبور	JGWP04700	قطر 0.2 ميكرومتر