Method Article

المجهري بفاصل زمني للموائع الدقيقة لدراسة ثبات المضادات الحيوية في البكتيريا

October 30th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Oms, T., et al. تحليل السكان والخلية المفردة لثبات المضادات الحيوية في الإشريكية القولونية. J. Vis. خبرة. (2023)

يقدم هذا الفيديو بروتوكولا لمراقبة الخلايا البكتيرية الفردية التي تعبر عن بروتين مرتبط بالحمض النووي المسمى بالفلورسنت داخل نظام الموائع الدقيقة. يوضح كيف تثبط المضادات الحيوية معظم الخلايا ، بينما تنجو مجموعة فرعية من الخلايا الثابتة من العلاج وتنمو مرة أخرى بعد إزالة المضادات الحيوية.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصوير المجهري بفاصل زمني الموائع الدقيقة

ملاحظه: يصف القسم التالي تحضير لوحة الموائع الدقيقة بالإضافة إلى إجراء الحصول على الصور بفاصل زمني وتحليل الصور. الهدف من هذه التجربة هو مراقبة وتحليل النمط الظاهري للثبات عند العلاج بالمضادات الحيوية على مستوى الخلية الواحدة. يمكن استخدام البيانات التي تم جمعها خلال هذه التجربة لتوليد مجموعة واسعة من النتائج اعتمادا على السؤال الذي تم تناوله و / أو مراسلي الفلورسنت الذين استخدموا أثناء التجربة. في التجربة الموضحة هنا ، تم إجراء تحليل كمي لطول الخلية وتألق HU-mCherry ، مما يعكس التنظيم النووي في الخلايا الثابتة وغير الثابتة.

  1. زراعة الخلايا البكتيرية للفحص المجهري بفاصل زمني للموائع الدقيقة
    1. تلقيح 5 مل من الجلسرين المتوسط (3- [N-morpholino] حمض البروبان سلفونيك (MOPS) 0.4٪ ، مع استكمال مضاد حيوي انتقائي إذا لزم الأمر) بمستعمرة معزولة في أنبوب زجاجي (≥25 مل) ، ووضع الأنبوب في حاضنة اهتزاز مضبوطة على 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة طوال الليل (بين 15 ساعة و 19 ساعة).
    2. في اليوم التالي ، قم بقياس OD600 نانومتر ، وقم بتخفيف المزرعة في وسط جديد معدل درجة الحرارة (37 درجة مئوية ، MOPS glycerol 0.4٪) في أنبوب زجاجي إلى ODنهائي 600 نانومتر ~ 0.001. دع المزرعة تنمو بين عشية وضحاها (بين 15 ساعة و 19 ساعة) في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة للحصول على ثقافة مبكرة في المرحلة الأسية في اليوم التالي.
  2. تحضير لوحة الموائع الدقيقة والتصوير المجهري بفاصل زمني
    ملاحظه: يمكن إجراء تجارب الموائع الدقيقة في أجهزة الموائع الدقيقة المتاحة تجاريا (كما هو موضح هنا) أو في أنظمة الموائع الدقيقة المنتجة داخليا.
    1. قم بإزالة محلول الحفظ (إن وجد) من كل بئر في صفيحة الموائع الدقيقة ، واستبدله بوسط ثقافة جديد.
      ملاحظه: إذا كانت لوحة الموائع الدقيقة تحتوي على بئر مخرج نفايات ، فيجب إزالة محلول الحفظ لبئر المخرج ولكن لا يتم استبداله بالوسيط.
    2. أغلق لوحة الموائع الدقيقة بنظام المشعب بالنقر فوق الزر "الختم " أو من خلال برنامج الموائع الدقيقة (حدد أولا "الأداة"، متبوعا بلوحة الختم).
      ملاحظه: لإغلاق اللوحة ، يجب تطبيق ضغط موحد على اللوحة والمشعب عن طريق الضغط يدويا على اللوحة على المشعب. إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، فيجب أن تظهر الملاحظة "مختومة" على واجهة ONIX2. من المهم عدم الضغط على الشريحة الزجاجية لتجنب أي خطر محتمل لكسر المشعب.
    3. بمجرد إغلاقها ، قم بإجراء تسلسل أولي (انقر فوق تشغيل تسلسل تحضير السائل على واجهة برنامج الموائع الدقيقة).
      ملاحظة: يتوافق تسلسل التحضير السائل لتشغيل 5 دقائق من التروية عند 6.9 كيلو باسكال للآبار 1-5 ، تليها 5 دقائق من التروية عند 6.9 كيلو باسكال للبئر 8 ، وجولة نضح أخيرة للبئر 6 لمدة 5 دقائق عند 6.9 كيلو باسكال. يسمح تسلسل التحضير السائل بإزالة محلول الحفظ الذي قد لا يزال موجودا في القنوات التي تربط الآبار المختلفة.
    4. احتضان اللوحة في خزانة يتم التحكم فيها حراريا في المجهر عند درجة الحرارة المطلوبة (هنا ، 37 درجة مئوية) لمدة لا تقل عن ساعتين قبل بدء التصوير المجهري.
    5. ابدأ تسلسل فتيلة سائل ثان قبل بدء التجربة.
    6. أغلق لوحة الموائع الدقيقة بالنقر فوق ختم على واجهة برنامج الموائع الدقيقة. استبدل الوسط في البئر 1 والبئر 2 ب 200 ميكرولتر من الوسط الطازج ، في البئر 3 ب 200 ميكرولتر من الوسط الطازج الذي يحتوي على المضاد الحيوي (هنا ، أوفلوكساسين (OFX) عند 5 ميكروغرام · مل −1) ، في البئر 4 والبئر 5 مع 200 ميكرولتر من الوسط الطازج ، في البئر 6 مع 200 ميكرولتر من الوسط الطازج ، وفي البئر 8 مع 200 ميكرولتر من عينة الاستزراع (من الخطوة 1.2) مخففة إلى OD600 نانومتر من 0.01 في الوسط الطازج.
    7. أغلق لوحة الموائع الدقيقة كما هو موضح في الخطوة 2.2 وضعها على هدف المجهر داخل خزانة المجهر.
      ملاحظه: تأكد من وضع قطرة من زيت الغمر على هدف المجهر قبل وضع لوحة الموائع الدقيقة.
    8. في برنامج الموائع الدقيقة ، انقر فوق تحميل الخلية للسماح بتحميل الخلية في لوحة الموائع الدقيقة.
      ملاحظه: تتكون خطوة تحميل الخلية من 15 ثانية من التروية عند 13.8 كيلو باسكال للبئر 8 ، تليها 15 ثانية من التروية عند 27.6 كيلو باسكال للبئر 6 والبئر 8 ، وجولة التروية النهائية للبئر 6 لمدة 30 ثانية عند 6.9 كيلو باسكال. تعد كثافة الخلايا في صفيحة الموائع الدقيقة أمرا بالغ الأهمية للتجربة. يتكون الجزء الأول من بروتوكول الموائع الدقيقة هذا من زراعة البكتيريا لمدة 6 ساعات في وسط جديد قبل العلاج بالمضادات الحيوية. بعد 6 ساعات من النمو ، يجب أن تكون كثافة الخلية كافية للكشف عن الخلايا الثابتة النادرة (في الظروف المستخدمة في هذه الدراسة ، تولد الخلايا الثابتة بتردد 10-4). إذا كانت كثافة الخلية عالية جدا ، فمن الصعب التمييز بين الخلايا الفردية ، مما يمنع التحليل الدقيق لخلية واحدة. نظرا لأن معدل النمو يعتمد بشكل مباشر على الوسط ، يجب تقييم كثافة الخلايا في حقول الفحص المجهري قبل بدء التجربة.
    9. قم بتعيين التركيز البؤري الأمثل باستخدام وضع الضوء المرسل، وحدد العديد من مناطق الاهتمام (ROIs) حيث يتم ملاحظة رقم خلية مناسب (حتى 300 خلية لكل مجال).
      ملاحظه: حدد 40 عائد استثمار على الأقل للتأكد من تصوير الخلايا الثابتة النادرة.
    10. في برنامج الموائع الدقيقة ، انقر فوق إنشاء بروتوكول. قم ببرمجة حقن الوسط الطازج عند 6.9 كيلو باسكال لمدة 6 ساعات (البئر 1-2) ، متبوعا بحقن الوسط المحتوي على المضاد الحيوي عند 6.9 كيلو باسكال لمدة 6 ساعات (البئر 3) ، وأخيرا حقن الوسط الطازج عند 6.9 كيلو باسكال لمدة 20 ساعة (الآبار 4-5).
      ملاحظه: تسمح المزرعة البكتيرية المخففة إلى OD600 نانومتر من 0.01 للبكتيريا بالنمو في غرفة الموائع الدقيقة لمدة 6 ساعات ، مما يضمن أن الخلايا في مرحلة النمو الأسي. اعتمادا على عدد الخلايا التي يتم إدخالها في جهاز الموائع الدقيقة أثناء خطوة التحميل (انظر الخطوة 2.8) ، يمكن تكييف مدة مرحلة النمو للحصول على ما يصل إلى 300 خلية لكل عائد استثمار. نظرا لأن الثبات ظاهرة نادرة ، فإن زيادة عدد الخلايا لكل عائد استثمار يحسن إمكانية مراقبة الخلايا الثابتة. ومع ذلك ، يجب ألا يتجاوز عدد الخلية 300 خلية لكل عائد استثمار ، لأن هذا يجعل تحليل الخلية المفردة مملا.
    11. قم بإجراء التصوير المجهري في وضع الفاصل الزمني بإطار واحد كل 15 دقيقة باستخدام الضوء المرسل ومصدر ضوء الإثارة لمراسل الفلورسنت. هنا ، تم استخدام مصدر ضوء إثارة 560 نانومتر لإشارة mCherry (580 نانومتر LED بقوة 10٪ مع مرشح 00 [530-585 ex ، 615LP em ، Zeiss] و 100 مللي ثانية تعرض ل mCherry). تم استخدام برنامج Zen3.2 المتوافق مع Zeiss لتصوير الخلايا.
  3. تحليل الصور
    ملاحظه: يتم فتح وتصور صور الفحص المجهري باستخدام برنامج ImageJ / Fiji مفتوح المصدر (https://fiji.sc/). يتم إجراء التحليل الكمي للصور باستخدام برنامج ImageJ / Fiji مفتوح المصدر والمكون الإضافي MicrobeJ المجاني (https://microbej.com). في هذا البروتوكول ، تم استخدام إصدار MicrobeJ 5.13I (14).
    1. افتح برنامج ImageJ/Fiji على الكمبيوتر، واسحب صور الفحص المجهري بفاصل زمني فائق التكديس إلى شريط تحميل فيجي. استخدم Image > Color > Make Composite لدمج القنوات المختلفة للمكدس الفائق. إذا كانت قنوات تجربة الفاصل الزمني لا تتوافق مع اللون المطلوب (على سبيل المثال، يظهر تباين الطور باللون الأحمر بدلا من الرمادي)، فاستخدم Image > Color > Arrange Channels لتطبيق اللون المناسب على القنوات.
    2. افتح المكون الإضافي MicrobeJ واكتشف الخلايا البكتيرية باستخدام واجهة التحرير اليدوي. احذف الخلايا المكتشفة تلقائيا وحدد يدويا الخلايا الثابتة ذات الاهتمام إطارا تلو الآخر.
      ملاحظه: يمكن استخدام إعدادات مختلفة للكشف التلقائي عن الخلايا الفردية. تم استخدام الكشف اليدوي هنا حيث تشكل الخلايا الثابتة التي تم تحليلها خيوطا طويلة ، والتي نادرا ما يتم اكتشافها بشكل صحيح باستخدام الكشف التلقائي.
    3. بعد الاكتشاف ، استخدم أيقونة النتيجة في واجهة التحرير اليدوي ل MicrobeJ لإنشاء جدول ResultJ. احفظ ملف ResultJ واستخدمه لاكتساب رؤى حول المعلمات المختلفة ذات الأهمية في تحليل الخلية الواحدة. في هذا البروتوكول ، تم تصدير متوسط التألق لشدة HU-mCherry وطول الخلية ومساحة الخلية للخلايا الفردية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أكسيو أوبزرفرزييس مجهر مضان مقلوب
فيجيإيمج جيhttps://fiji.sc/برنامج الصور Schindelin et al. إذا استخدم في النشر
الإشريكية القولونية K-12 MG1655 CF1648 (fnr +) بي 10سلالة مرجعية بالوزن ، إجهاد المختبر
الإشريكية القولونية K-12 MG1655 CF1648 (fnr +) hupA-mCherry :: FRT-kan-FRT بي إيه 16اندماج HU-mCherry مدمج عبر نقل P1 في الموضع الأصلي ، سلالة المختبر
نظام الموائع الدقيقة CellASIC ONIXميرككاكس 2-S0000نظام الموائع الدقيقة
لوحات الموائع الدقيقة CellASIC ONIXميركB04A-03-5PKلوحة لنظام الموائع الدقيقة
سيلاسيك ONIX2 FGميركأونيكس2 1.0.1برنامج الموائع الدقيقة
CellASIC ONIX2 مشعب أساسيميركCAX2-MBC20نظام المشعب
ميكروب Jالبرنامج المساعد Imagej / فيجيhttps://www.microbej.com/البرنامج المساعد لتحليل الصور المجهري. Ducret et al.for في النشر. إعدادات الكشف: للبكتيريا: المساحة (ميكروم2): 0,1-كحد أقصى ؛ الطول (ميكرومتر): 0,5 كحد أقصى ؛ العرض (ميكرومتر): 0,6 كحد أقصى ؛ المدى (ميكرومتر): 0,5 كحد أقصى ؛ الزاوية (راد): 0-0,3 ؛ 0-كحد أقصى لجميع المعلمات الأخرى.
زيت الغمر زايس® 518Fزييس زيت الغمر لزيادة دقة المجهر
Zen3.2 بروزييس برنامج الحصول على الصور المجهرية ومعالجتها
أوفلوكساسينميرك82419-36-1المضاد الحيوي الفلوروكينولون يستخدم لعلاج الخلايا البكتيرية
CaCl₂·2H₂Oميرك1.02382.0250بالنسبة إلى MOPS الجلوكوز 0.4٪ و MOPS الجلسرين 0.4٪ متوسط النمو
CoCl₂ · 6H₂Oميرك1.02539.0100بالنسبة إلى MOPS الجلوكوز 0.4٪ و MOPS الجلسرين 0.4٪ متوسط النمو
CuSO₄ · 5H₂Oميرك1.02790.0250بالنسبة إلى MOPS الجلوكوز 0.4٪ و MOPS الجلسرين 0.4٪ متوسط النمو
د- (+) - جلوكوزسيجما ألدريتشجي 7021-1 كجممصدر الكربون ل MOPS الجلوكوز 0.4٪ متوسط النمو
FeSO₄·7H₂Oكيماويات VWR24244.232بالنسبة إلى MOPS الجلوكوز 0.4٪ و MOPS الجلسرين 0.4٪ متوسط النمو
الجلسرينميرك56815مصدر الكربون ل MOPS الجلسرين 0.4٪ متوسط نمو
H₃BO₃سيجما ألدريتشب6768-1 كجمبالنسبة إلى MOPS الجلوكوز 0.4٪ و MOPS الجلسرين 0.4٪ متوسط النمو
K₂HPO₄ميرك1.05099.1000بالنسبة إلى MOPS الجلوكوز 0.4٪ و MOPS الجلسرين 0.4٪ متوسط النمو
كوهميرك1.05029.1000بالنسبة إلى MOPS الجلوكوز 0.4٪ و MOPS الجلسرين 0.4٪ متوسط النمو
كيلو سو₄ميرك1.05153.0500بالنسبة إلى MOPS الجلوكوز 0.4٪ و MOPS الجلسرين 0.4٪ متوسط النمو
MgCl₂·6H₂Oميرك1.05832.1000بالنسبة إلى MOPS الجلوكوز 0.4٪ و MOPS الجلسرين 0.4٪ متوسط النمو
MnCl₂·4H₂Oميرك1.05927.0100بالنسبة إلى MOPS الجلوكوز 0.4٪ و MOPS الجلسرين 0.4٪ متوسط النمو
MOPS ، درجة ULTROL® من الحمض الحرميرك475898-500 جرامبالنسبة إلى MOPS الجلوكوز 0.4٪ و MOPS الجلسرين 0.4٪ متوسط النمو
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتشS5886-1 كجمبالنسبة إلى MOPS الجلوكوز 0.4٪ و MOPS الجلسرين 0.4٪ متوسط النمو
(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂Oميرك1.01180.0250بالنسبة إلى MOPS الجلوكوز 0.4٪ و MOPS الجلسرين 0.4٪ متوسط النمو
NH₄Clميرك1.01145.0500بالنسبة إلى MOPS الجلوكوز 0.4٪ و MOPS الجلسرين 0.4٪ متوسط النمو
N- [تريس (هيدروكسي ميثيل) -ميثيل] - جلايسينميرك1.08602.0250بالنسبة إلى MOPS الجلوكوز 0.4٪ و MOPS الجلسرين 0.4٪ متوسط النمو
ZnSO₄·7H₂Oميرك1.08883.0500بالنسبة إلى MOPS الجلوكوز 0.4٪ و MOPS الجلسرين 0.4٪ متوسط النمو

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic Time Lapse MicroscopyAntibiotic PersistenceBacterial CellsFluorescent ReporterNucleoid VisualizationSingle Cell AnalysisMicrofluidic PlateTime Lapse ImagingPersister CellsDNA Binding Protein

Related Articles