فحص معدلات ممارسات التصنيع الجيدة الدورية باستخدام البكتيريا التي تعبر عن بروتين مراسل الفلورسنت

Abstract

المصدر: Rugjee, K. N., et al. إنشاء إعداد عالي الإنتاجية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعدل إشارات c-di-GMP في Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. خبرة. (2016).

يوضح هذا الفيديو فحص معدلات di-GMP الدورية باستخدام البكتيريا المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) تحت سيطرة محفز حساس ل c-di-GMP. يتم قياس التألق في صفيحة متعددة الآبار تحتوي على مركبات اختبار مختلفة. المركبات التي تمنع إنتاج c-di-GMP تؤدي إلى انخفاض التألق. ثم يتم تحليل البيانات لتحديد المعدلات المحتملة لإشارات c-di-GMP في البكتيريا.

Protocol

1. توليد البروتين الفلوري الأخضر (GFP) الموسومة دوري ثنائي GMP (c-di-GMP) مراسل Pseudomonas aeruginosa سلالة

1. تلقيح 5 مل من وسط مرق الليسوجين (LB) بمستعمرة واحدة من P. aeruginosa واحتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
2. انقل 2 مل من المزرعة الليلية إلى 200 مل من وسط LB الطازج في قارورة سعة 1 لتر واحتضنه عند 37 درجة مئوية مع الرج عند 200 دورة في الدقيقة.
3. راقب الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (_{OD 600}) كل 30 دقيقة عن طريق أخذ عينة 1 مل من القارورة وفحصها باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
4. عندما يصل OD₆₀₀ إلى ما بين 0.3 - 0.5 ، ضع 40 مل من المزرعة في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل.
5. قم بإزالة الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 8,000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 40 مل من محلول السكروز المثلج المثلج المعقم 300 ملليمتر.
6. قم بإزالة الخلايا مرة ثانية عن طريق الطرد المركزي كما هو موضح في الخطوة 1.5 وأعد تعليقها في 20 مل من محلول السكروز المثلج البارد والمعقم 300 ملي مولار.
7. قم بإزالة الخلايا للمرة الأخيرة عن طريق الطرد المركزي كما هو موضح في الخطوة 1.5 وأعد تعليقها في 400 ميكرولتر من محلول السكروز المثلج البارد والمعقم 300 ملليمتر.
   ملاحظة: يجب أن تكون كثافة الخلية في هذه المرحلة حوالي 1 × 10¹¹ وحدة تشكيل مستعمرة لكل مليلتر (CFU / مل).
8. قم بتبريد الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة ، وبعد ذلك تصبح جاهزة للتثقيب الكهربائي.
9. أضف 1 ميكرولتر من محلول بلازميد 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر pCdrA :: gfp^C إلى 40 ميكرولتر من الخلايا المختصة بالكهرباء P. aeruginosa المحضرة أعلاه في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل تم تبريده مسبقا على الجليد. امزج التعليق وانقله إلى فجوة كهربائية مبردة مسبقا ، 2 مم ، كوفيت التثقيب الكهربائي.
10. قم بإزالة الرطوبة من السطح الخارجي للكوفيت باستخدام مناديل ورقية وضع الكوفيت في حجرة العينة في المثقب الكهربائي. نبض بجهد 2.5 كيلو فولت ، سعة 25 ميكرو فهرنهايت ، ومقاومة 200 Ω.
11. أخرجي الكوفيت وأضيفي 1 مل من وسط LB. بعد ذلك ، انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل واحتضان لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
12. انشر 10 ميكرولتر و 50 ميكرولتر و 100 ميكرولتر من الكمية من المزرعة على ألواح LB-agar معقمة مكملة بالأمبيسلين (بتركيز 100 ميكروغرام / مل) ، واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
13. قم بتأكيد تعبير GFP (الإثارة عند 485 نانومتر ، والانبعاث عند 520 نانومتر) عن طريق فحص اللوحة تحت مجهر مضان بقناة GFP قياسية ، واختر مستعمرة واحدة لتلقيح 5 مل رطل. احتضان بين عشية وضحاها كما هو موضح في الخطوة 1.1. امزج 0.5 مل من المزرعة طوال الليل مع 0.5 مل 50٪ جلسرين في أنبوب علوي لولبي سعة 2 مل وقم بتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

2. تحضير ثقافة المبتدئين للتطعيم

1. قبل يومين من الشاشة ، قم بوضع سلالة P. aeruginosa (التي تحتوي على pCdrA :: gfp^C plasmid) من مخزون -80 درجة مئوية على صفيحة LB-agar (مكملة بالأمبيسلين بتركيز 100 ميكروغرام / مل) عن طريق نشر البكتيريا برفق على اللوحة باستخدام حلقة تلقيح معقمة. احتضن الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
2. في المساء السابق للفحص ، يتم تلقيح مستعمرة واحدة من المتصورة الزنجارية من اللوحة في 10 مل من وسط LB (مكمل بالأمبيسلين بتركيز 100 ميكروغرام / مل) في أنبوب واحتضان ما قبل الاستزراع طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
3. في يوم الشاشة ، قم بإعداد ثقافة فرعية من الاستزراع المسبق بين عشية وضحاها عن طريق تخفيفها أولا بوسط LB طازج إلى OD₆₀₀ من 1.0 ثم مزيد من التخفيف ب 5٪ LB إلى OD₆₀₀ من 0.04 (نسبة 1:25).
   ملاحظة: يعتمد الحجم الإجمالي للوسط الملقح على عدد اللوحات المراد اختبارها. يتم تصنيع 5٪ رطل عن طريق تخفيف 100٪ رطل مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى التركيز المطلوب. الأهم من ذلك ، أن الوسائط (5٪ رطل) تسمح بالتنشيط التأسيسي ل pCdrA :: gfp^C في P. الزنجارة.
4. أضف قضيب تحريك مغناطيسي معقم إلى الحاوية وحرك المزرعة بأقل سرعة على محرك مغناطيسي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، مما يسمح للبكتيريا بالتأقلم مع الوسائط قبل توزيعها في ألواح 384 بئرا.

3. تلقيح وحضانة ألواح 384 بئرا تحتوي على جزيئات صغيرة

ملاحظة: يعد العقم وتقنيات التعقيم الجيدة أمرا بالغ الأهمية للخطوات التالية.

1. لتحضير العنصر المثبت (تثبيط 100٪)، يضاف 20 ميكرولتر من كبريتات توبراميسين (25 ملغم/مل) إلى 10 مل (يكفي لما يصل إلى 12 طبقا) من الاستزراع الفرعي المحضر في الخطوة 2.3 ويخلط بلطف. ماصة 40 ميكرولتر من ثقافة التحكم الإيجابية في الآبار A23-P23 (الشكل 1).
2. لتحضير التحكم السلبي (تثبيط 0٪) ، أضف 30 ميكرولتر ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى 10 مل (يكفي لما يصل إلى 12 لوحة) من الاستزراع الفرعي المحضر في الخطوة 2.3 واخلطه بلطف. ماصة 40 ميكرولتر من ثقافة التحكم السلبية في الآبار A24-P24 (الشكل 1).
3. لكل لوحة مختومة بالجزيئات الصغيرة ، قم بتلقيح حجم 40 ميكرولتر من الثقافات المخففة بين عشية وضحاها (الموضحة في الخطوة 2.3) في الآبار A1-P22 (الشكل 1).
   ملاحظة: يمكن تحقيق ذلك باستخدام روبوت معالج السوائل. نظرا للخصائص غير المتجانسة للثقافات البكتيرية ، من المهم الحفاظ على تحريض مستمر ومعتدل للحفاظ على توزيع البكتيريا باستمرار في الوسائط أثناء الاستغناء. للقيام بذلك ، استمر في تقليب الثقافة المتأقلمة من الخطوة 2.4 مغناطيسيا أثناء الاستغناء.
4. أغلق الألواح بختم غطاء نفاذه للهواء واحتضان لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: يعد مانع التسرب المنفذ للهواء أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على الظروف غير المتغيرة عبر جميع الآبار البالغ عددها 384 بئرا والتحايل على التطور المحتمل لتدرجات الأكسجين عبر اللوحة.

4. قياس النمو (OD600) ومستوى c-di-GMP داخل الخلايا (GFP)

1. قبل حوالي 30 دقيقة من القياس الطيفي الضوئي ، قم بتسخين قارئ اللوحة مسبقا إلى 37 درجة مئوية لتجنب التكثيف.
2. قم بإزالة ختم الغطاء المنفذ للهواء برفق قبل القراءة. قم بقياس الكثافة الضوئية بطول موجي يبلغ 600 نانومتر مع إعداد 10 ومضات لكل بئر ووقت تسوية 0.2 ثانية.
3. قبل قياس التألق ، قم بإجراء كسب تلقائي وضبط بؤري بناء على البئر A24 (التحكم السلبي) وقم بتعيين القيمة المستهدفة للكسب عند 75٪ (الشكل 1).
   1. من برنامج التحكم في قارئ اللوحة ، انقر فوق بدء القياس وانقر فوق علامة التبويب "ضبط التركيز والكسب / معرفات اللوحة".
   2. حدد "ضبط التركيز" و "القناة أ" على اليمين من النافذة.
   3. حدد "ضبط الكسب" و "محدد جيدا" ، واكتب "75" ك "القيمة المستهدفة". أخيرا ، اختر جيدا A24 في تخطيط اللوحة قبل النقر فوق "بدء الضبط". بمجرد إجراء الضبط ، انقر فوق "بدء القياس".
   4. قم بقياس التألق من مراسل GFP بحد أقصى للإثارة/الانبعاث يبلغ 485/520 نانومتر مع إعداد 10 ومضات لكل بئر ووقت تسوية 0.2 ثانية.
4. جمع البيانات من جميع اللوحات التي تم فحصها.
   ملاحظة: يتم حفظ قراءات البيانات تلقائيا كإعداد افتراضي بواسطة برنامج التحكم في قارئ اللوحة.
   1. عرض القراءات بالنقر فوق أيقونة "المريخ" داخل برنامج التحكم لفتح حزمة التحليل الإحصائي.
   2. استرجع البيانات عن طريق "النقر المزدوج" على رقم اللوحة محل الاهتمام للوصول إلى البيانات لتحليلها.

Results

الشكل 1. خريطة لوحة 384 بئرا تستخدم لمقايسة فحص الجزيئات الصغيرة. يتم تصنيف المركبات من المكتبة (الأزرق الفاتح) إلى الآبار A1-P22. يضاف "التحكم الإيجابي" (الأحمر) ، الذي يتكون من تركيز نهائي قدره 50 ميكروغرام / مل من كبريتات التوبراميسين ، إل...

Materials