تقنية لتحضير مزرعة بكتيرية وحيدة النسيلة

الملخص

المصدر: Lin, P., et al. توليف كبسولات تونجستات الصوديوم وموليبدات الصوديوم الدقيقة عن طريق إفراز المعادن البكتيرية. J. Vis. خبرة. (2018).

يوضح هذا الفيديو تحضير مزرعة بكتيرية وحيدة النسيلة لإنتاج المعادن من خلال التخفيف التسلسلي وعزل المستعمرة على صفيحة أجار. عن طريق هز اللوحة بالخرز الزجاجي ، يتم فصل الخلايا الفردية مكانيا لتشكيل مستعمرات موحدة وراثيا ، والتي يتم نقلها بعد ذلك إلى وسائط سائلة للنمو. يتم اختيار المزرعة ذات التعكر الأعلى ، مما يشير إلى كثافة السكان أحادية النسيلة وأكبر إمكانات الإنتاج المعدني.

البروتوكول

1. تحضير الخرز الزجاجي

1. ضع 100 حبة زجاجية بقطر 3 مم في زجاجة مختبر سعة 100 مل ، ثم قم بتغطيتها بإحكام.
2. قم بتعقيم المحتويات عند 120 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
3. اترك الزجاجة لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة ، ثم ضعها في خزانة السلامة البيولوجية.

2. تحضير مرق الليسوجيني (LB)

1. قم بإذابة مسحوق 8 جم من مرق LB-Lennox في زجاجة مختبر سعة 500 مل مع 400 مل من الماء.
2. قلب المحتويات باستخدام قضيب التحريك المغناطيسي من البولي تترافلورو إيثيلين (PTFE) لمدة 20 دقيقة ، ثم قم بتغطيته بإحكام.
3. قم بتعقيم المحتويات عند 120 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
4. اترك المحلول ليبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة وضعه في خزانة السلامة البيولوجية.
5. باستخدام ماصة ، قم بتقسيم المرق إلى ثمانية أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل (12.5 مل لكل منها) في خزانة السلامة الحيوية.
6. قم بتقسيم المرق المتبقي إلى ثلاث زجاجات مختبر سعة 100 مل في خزانة السلامة الحيوية (100 مل لكل منها). قم بتغطية الزجاجات الثلاث بإحكام. احتفظ بها في خزانة السلامة البيولوجية.

3. ثقافة طحالب شيوانيلا

1. استخدم السلالة المحفوظة بالتبريد.
2. في خزانة السلامة الحيوية ، اختر 1 مل من المادة المجمدة من الأنبوب المجمد بملعقة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، وضعها في أنبوب طرد مركزي معد في الخطوة 3.5.
3. احتضان الثقافات لمدة 24 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية.

4. تحضير أطباق LB-Lennox (مرق مع أجار) بتري

1. قم بإذابة قرصين من LB-Lennox (مرق مع أجار) في زجاجة مختبر سعة 100 مل مع 100 مل من الماء.
2. قلب المحتويات باستخدام قضيب التحريك المغناطيسي PTFE لمدة 20 دقيقة ثم قم بتغطيته بإحكام.
3. قم بتعقيم المحتويات عند 120 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
4. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتوزيع 100 مل من المحلول يدويا في 4 أطباق بتري ، مما يضمن حصول كل منها على ~ 25 مل. اترك المحلول ليبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة.

5. تحضير البكتيريا وحيدة النسيلة

1. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتسمية الزجاجات الثلاث المحضرة في الخطوة 2.6 و # 1 و # 2 و # 3 على التوالي.
2. ماصة 0.1 مل من المعلق البكتيري الناتج في الخطوة 3.3 في الزجاجة # 1. قم بتغطية الزجاجة وقم بتأرجحها يدويا لمدة 1 دقيقة للحصول على محلول متجانس.
3. ماصة 0.1 مل من السائل البكتيري الناتج في الخطوة 5.2 في زجاجة # 2. قم بتغطية الزجاجة وقم بتأرجحها يدويا لمدة 1 دقيقة للحصول على محلول متجانس.
4. ماصة 0.1 مل من السائل البكتيري الناتج في الخطوة 5.3 في زجاجة # 3. قم بتغطية الزجاجة ورجها باليد لمدة 1 دقيقة للحصول على محلول متجانس.
5. قم بوضع السائل في زجاجة # 3 في 4 أطباق بتري المحضرة في الخطوة 4.4 ، باستخدام حجم 0.02 مل لكل منها.
6. ضع الخرز الزجاجي المحضر في الخطوة 1.3 في 4 أطباق بتري المستخدمة ، 4 حبات في كل طبق.
7. أغلق أغطية أطباق بتري ورجها يدويا لمدة 1 دقيقة.
8. اقلب أطباق بتري رأسا على عقب واحتضنها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

6. تكاثر البكتيريا وحيدة النسيلة

1. اجلب 7 أنابيب محضرة في الخطوة 2.5.
2. اختر البكتيريا أحادية النسيلة الناتجة من 4 أطباق Petri المحضرة في الخطوة 5.8 باستخدام ملعقة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، وضعها في 7 أنابيب بشكل منفصل.
3. اترك الأنابيب ال 7 في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
4. اختر الشخص الذي يحتوي على أكبر تشتت للضوء باستخدام طريقة القياس اللوني المرئي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
LB (مرق لينوكس) مع أقراص أجار	سيجما ألدريتش	L7075	1 قرص ل 50 مل مرق مع أجار
رطل (مرق لينوكس)	سيجما ألدريتش	L3022-1 كجم	مسحوق LB (Lennox) 1 كجم
سكر العنب اللامائي	كاشف Nihon Shiyaku	78695 ر.ل	الجلوكوز
أنبوب الطرد المركزي 50 مل	صقر	14-432-22
أنبوب الطرد المركزي 15 مل	صقر	14-959-53 أ
زجاجة مختبر 100 مل	دوران	21 801 24 5
زجاجة مختبر 500 مل	دوران	21 801 44 5
ملعقة من الفولاذ المقاوم للصدأ	كيمزجاج	سي جي - 1981-10
PTFE قضبان التحريك القابل للتصرف	صياد	ط68066
أطباق بتري بلاستيكية	صياد	S33580A
حاضنه	صنع العميل	حسب الطلب	يسخن إلى 40 درجة مئوية أو يبرد إلى 18 درجة مئوية مع زمن cotrol
خزانة السلامة الحيوية	تسونج ين المحدودة	زيبه-420	تتم جميع العمليات المتعلقة بالبكتيريا هنا
الأوتوكلاف	Tomin Medical Equipmenco، Ltd. ، مدينة تايبيه ، تايوان ، ROC	TM-329	يسخن إلى 120 درجة مئوية لمدة 10 دقائق