تخليق كبسولات أكسيد المعادن الدقيقة باستخدام بكتيريا مختزلة المعادن

الملخص

المصدر: Lin, P., et al. توليف كبسولات تونجستات الصوديوم وموليبدات الصوديوم الدقيقة عن طريق إفراز المعادن البكتيرية. J. Vis. إكسب. (2018).

يوضح هذا الفيديو إجراء تصنيع كبسولات أكسيد المعادن الصلبة عن طريق زراعة البكتيريا المختزلة للمعادن مع أيونات المعادن ، متبوعا بالتنقية المتسلسل من خلال الصوتنة والطرد المركزي وغسل الإيثانول.

البروتوكول

تنبيه: استخدم قفازات اللاتكس والنظارات الواقية ومعطف المختبر لإجراء التجربة. عند استخدام خزانة السلامة الحيوية ، قم بتشغيل مروحة الخزانة واحتفظ بباب الخزانة نصف مغلق.

1. تحضير الخرز الزجاجي

1. ضع 100 حبة زجاجية بقطر 3 مم في زجاجة مختبر سعة 100 مل ، ثم قم بتغطيتها بإحكام.
2. قم بتعقيم المحتويات عند 120 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
3. اترك الزجاجة لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة ، ثم ضعها في خزانة السلامة البيولوجية.

2. تحضير مرق الليسوجيني (LB)

1. قم بإذابة 8 جم من مسحوق مرق LB-Lennox في زجاجة مختبر سعة 500 مل مع 400 مل من الماء.
2. قلب المحتويات باستخدام قضيب التحريك المغناطيسي PTFE (Polytetrafluoroethylene) لمدة 20 دقيقة ، ثم قم بتغطيته بإحكام.
3. قم بتعقيم المحتويات عند 120 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
4. اترك المحلول ليبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة وضعه في خزانة السلامة البيولوجية.
5. باستخدام ماصة ، قم بتقسيم المرق إلى ثمانية أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل (12.5 مل لكل منها) في خزانة السلامة الحيوية.
6. قم بتقسيم المرق المتبقي إلى ثلاث زجاجات مختبر سعة 100 مل (100 مل لكل منها) في خزانة السلامة الحيوية. قم بتغطية الزجاجات الثلاث بإحكام واحتفظ بها في خزانة السلامة البيولوجية.

3. ثقافة طحالب شيوانيلا

1. استخدم السلالة المحفوظة بالتبريد.
2. في خزانة السلامة الحيوية ، اختر 1 مل من المادة المجمدة من الأنبوب المجمد بملعقة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، وضعها في أنبوب طرد مركزي معد في الخطوة 3.5.
3. احتضان الثقافات لمدة 24 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية.

4. تحضير أطباق LB-Lennox (مرق مع أجار) بتري

1. قم بإذابة قرصين من LB-Lennox (مرق مع أجار) في زجاجة مختبر سعة 100 مل مع 100 مل من الماء.
2. قلب المحتويات باستخدام قضيب التحريك المغناطيسي PTFE لمدة 20 دقيقة ثم قم بتغطيته بإحكام.
3. قم بتعقيم المحتويات عند 120 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
4. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتوزيع 100 مل من المحلول يدويا في 4 أطباق بتري ، مما يضمن حصول كل منها على ~ 25 مل. اترك المحلول ليبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة.

5. تحضير البكتيريا وحيدة النسيلة

1. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتسمية الزجاجات الثلاث المحضرة في الخطوة 2.6 و # 1 و # 2 و # 3 على التوالي.
2. ماصة 0.1 مل من المعلق البكتيري الناتج في الخطوة 3.3 في الزجاجة # 1. قم بتغطية الزجاجة وقم بتأرجحها يدويا لمدة 1 دقيقة للحصول على محلول متجانس.
3. ماصة 0.1 مل من السائل البكتيري الناتج في الخطوة 5.2 في زجاجة # 2. قم بتغطية الزجاجة وقم بتأرجحها يدويا لمدة 1 دقيقة للحصول على محلول متجانس.
4. ماصة 0.1 مل من السائل البكتيري الناتج في الخطوة 5.3 في زجاجة # 3. قم بتغطية الزجاجة ورجها باليد لمدة 1 دقيقة للحصول على محلول متجانس.
5. قم بوضع السائل في زجاجة # 3 في 4 أطباق بتري المحضرة في الخطوة 4.4 ، باستخدام حجم 0.02 مل لكل منها.
6. ضع الخرز الزجاجي المحضر في الخطوة 1.3 في 4 أطباق بتري المستخدمة ، 4 حبات في كل طبق.
7. أغلق أغطية أطباق بتري ورجها يدويا لمدة 1 دقيقة.
8. اقلب أطباق بتري رأسا على عقب واحتضنها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

6. تكاثر البكتيريا وحيدة النسيلة

1. اجلب 7 أنابيب محضرة في الخطوة 2.5.
2. اختر البكتيريا أحادية النسيلة الناتجة من 4 أطباق Petri المحضرة في الخطوة 5.8 باستخدام ملعقة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، وضعها في 7 أنابيب بشكل منفصل.
3. اترك الأنابيب ال 7 في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
4. اختر الشخص الذي يحتوي على أكبر تشتت للضوء باستخدام طريقة القياس اللوني المرئي.

7. تحضير مرق LB-Lennox مع الجلوكوز والملح

1. ضع 10 جم من مرق LB-Lennox و 10 جم من كلوريد الصوديوم و 10 جم من الجلوكوز في زجاجة مختبر سعة 500 مل. أضف الماء حتى يصل الحجم إلى 450 مل.
2. قلب المحتويات باستخدام قضيب التحريك المغناطيسي PTFE لمدة 20 دقيقة.
3. قم بتعقيم المحتويات عند 120 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

8. تحضير تنغستات الصوديوم

1. ضع 16.5 جم من تنغستات الصوديوم Na₂WO_{4.2H 2}O في زجاجة مختبر سعة 100 مل بملعقة من الفولاذ المقاوم للصدأ. أضف الماء حتى يصل الحجم إلى 50 مل.
2. قلب المحتويات باستخدام قضيب التحريك المغناطيسي PTFE لمدة 20 دقيقة.
3. قم بتعقيم المحتويات عند 120 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
4. في خزانة السلامة الحيوية ، احصل على ترشيح عبر مرشح من الألياف الزجاجية مفرغة بمسام 1 ميكرومتر.

9. تحضير LB مع الجلوكوز والملح وتنغستات الصوديوم

1. في خزانة السلامة الحيوية ، اسكب المرشح المكتسب في الخطوة 8.4 يدويا في المحلول مع الجلوكوز والملح المحضر في الخطوة 7.3.
2. في خزانة السلامة البيولوجية، قم بإضافة المحلول الناتج سعة 500 مل باستخدام ماصة في الخطوة 9.1 إلى أنابيب طرد مركزي سعة 10 × 50 مل.

10. ثقافة البكتيريا

1. في خزانة السلامة البيولوجية، أحضر السائل المحضر في الخطوة 6.4 وأضعه بماصة في 10 أنابيب اختبار محضرة في الخطوة 9.2، مع تلقي كل أنبوب 0.05 مل.
2. احتضان الأنابيب العشرة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 120 ساعة.

11. حصاد معادن BME

1. بالموجات فوق الصوتية كل من 10 أنابيب في الخطوة 9.2 في 20 كيلو هرتز مع 150 واط لمدة 1 ساعة.
2. جهاز طرد مركزي للأنابيب عند 2,025 × جم لمدة 1 ساعة.
3. قم بإزالة السائل الصافي في الأنابيب باستخدام ماصة ، وأضف الماء ، ثم كرر الخطوتين 11.1 و 11.2 مرة أخرى.
4. قم بإزالة السائل الصافي في الأنابيب باستخدام ماصة ، وأضف الكحول ، ثم قم بتشغيلها بالموجات فوق الصوتية عند 20 كيلو هرتز مع 150 واط لمدة ساعة واحدة.
5. جهاز طرد مركزي للأنابيب عند 2,025 × جم لمدة 1 ساعة.
6. كرر الخطوتين 11.4 و11.5 مرة أخرى
7. حصاد معادن BME عن طريق إزالة السائل الصافي في الأنابيب باستخدام ماصة ؛ بعد ذلك ، قم بتغطية الأنابيب على الفور دون إجراء أي عملية تجفيف.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مرق LB (Lennox) مع أقراص أجار	سيجما ألدريتش	L7075	1 قرص ل 50 مل مرق مع أجار
مرق LB (Lennox)	سيجما ألدريتش	L3022-1 كجم	مسحوق LB (Lennox) 1 كجم
سكر العنب اللامائي	كاشف Nihon Shiyaku	78695 ر.ل	الجلوكوز
تنغستات الصوديوم	كاشف Nihon Shiyaku	76050 رطل	[نا2و]4 · 2H2O
كلوريد الصوديوم	كاشف Nihon Shiyaku	ر.ل 68131	كلوريد الصوديوم
الإيثانول 99.5٪	أكروس عضوية	AC615090040	CH3CH2OH
الماء	صنع في جامعتنا		المياه منزوعة الأيونات
الأوتوكلاف	Tomin Medical Equipmenco، Ltd. ، مدينة تايبيه ، تايوان ، ROC	TM-329	يسخن إلى 120 درجة مئوية لمدة 10 دقائق
الطرد المركزي	نظام مختبر نظام الأرقام ، مدينة تايبيه الجديدة ، تايوان ، ROC	DSC302SD	جهاز طرد مركزي في 2025 × جم
-80 درجة مئوية ثلاجة	باناسونيك	MDF-U3386S	يستخدم للتجميد العميق لسلالة الحفظ بالتبريد
الموجات فوق الصوتية الخالط الصوتيات معالج الخلية المعطلة	لينوكس	يو بي إس-150	تردد 20 كيلو هرتز قوة 150 واط
حاضنه	صنع العميل	حسب الطلب	يسخن إلى 40 درجة مئوية أو يبرد إلى 18 درجة مئوية مع زمن cotrol
حمامات الاهتزاز المتبادلة	Kingtech العلمية المحدودة	WBS-L
لوحة ساخنة رقمية للتحريك	كورنينج	# 6797-620 د	استخدم مع شريط التحريك المغناطيسي PTFE
خزانة السلامة الحيوية	تسونج ين المحدودة	زيبه-420	تتم جميع العمليات المتعلقة بالبكتيريا هنا
أنبوب الطرد المركزي 50 مل	صقر	14-432-22
أنبوب الطرد المركزي 15 مل	صقر	14-959-53 أ
زجاجة مختبر 100 مل	دوران	21 801 24 5
زجاجة مختبر 500 مل	دوران	21 801 44 5
ملعقة من الفولاذ المقاوم للصدأ	كيمزجاج	سي جي - 1981-10
PTFE قضبان التحريك القابل للتصرف	صياد	ط68066
أطباق بتري بلاستيكية	صياد	S33580A
طحالب شيوانيلا	بإذن من المؤلف # 3	بإذن من المؤلف # 3