تقييم تأثير البكتيريا المفيدة على الانتقال الميكروبي في الأمعاء في الفئران المجهدة حراريا

الملخص

المصدر: Sorokulova, I., et al. الوقاية من الآثار السلبية الإجهاد الحراري في الفئران بواسطة سلالة عصيات رقيقة . J. Vis. خبرة. (2016)

يوضح هذا الفيديو الفئران المعالجة مسبقا بالبكتيريا المفيدة أو المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) وتعرضت للإجهاد الحراري لتقييم سلامة حاجز الأمعاء. يشير عدد أقل من المستعمرات البكتيرية المشتقة من الأمعاء من كبد الفئران المعالجة ، على عكس العديد من المستعمرات في الفئران الضابطة ، إلى حاجز ظهاري سليم والحد الأدنى من الانتقال البكتيري.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. التصميم التجريبي

1. ابدأ علاج عن طريق التزقيم عن طريق الفم ، بعد 2 أيام من التأقلم. استخدم حقنة بإبرة التزقيم الفموية. عالج 16 فأر بمعلق Bacillus subtilis BSB3 (1 مل لكل فأر) مرتين يوميا لمدة يومين (مجموعة B. subtilis). عالج 16 فأر بالمحلول الملحي المخزن بالفوسفات ، PBS (1 مل لكل فأر) ، مرتين يوميا لمدة يومين (مجموعة PBS) (الشكل 1).
2. بعد العلاج ، قسم كل مجموعة (8 فئران لكل مجموعة): المجموعة 1 - التحكم (PBS / بدون إجهاد) ، المجموعة 2-B. subtilis (B. subtilis / بدون إجهاد) ، المجموعة 3 - الإجهاد (PBS / الإجهاد الحراري) والمجموعة 4 - B. subtilis + الإجهاد (B. subtilis / الإجهاد الحراري).
3. قم بقياس درجة حرارة المستقيم لكل فأر باستخدام مقياس حرارة رقمي إلكتروني. احتفظ بفئران المجموعتين 1 و 2 في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة. ضع من المجموعتين 3 و 4 في غرفة مناخية عند 45 درجة مئوية ورطوبة نسبية 55٪ لمدة 25 دقيقة.
4. بعد ذلك ، قم بقياس درجة حرارة المستقيم لكل فأر في جميع المجموعات باستخدام مقياس حرارة رقمي إلكتروني. ضع جميع في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات.
5. قم بتخدير الفئران باستخدام الأيزوفلوران (2-4٪) في جرة تخدير قابلة للغلق وراقب حتى يتم تخدير الفئران بعمق (عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم). القتل الرحيم للفئران عن طريق قطع الرأس بسرعة بالمقصلة.
6. اجمع دم الجذع من كل فأر (15-16 مل) باستخدام الماصات الحميرية في أنابيب أبيروجينيك للحصول على مصل ، وأخذ على الفور عينات من الدم (7 ميكرولتر من كل فأر) باستخدام ماصة للفحص المجهري.
7. ضع الأنابيب مع الدم في الثلاجة لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح بالتخثر. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 20 درجة مئوية ، 7,000 × جم لمدة 10 دقائق ، وقم بإزالة المصل بسرعة باستخدام ماصة. Aliquot المصل الذي تم الحصول عليه من كل فأر إلى أحجام 50 ميكرولتر وتخزينه عند -20 درجة مئوية حتى الفحص.

2. الإجراء الجراحي

1. قص / تقليم كل الفراء من البطن والصدر من الجانب السفلي من الذبيحة باستخدام مقصات كهربائية. ضع الذبيحة في خزانة معقمة وعالج السطح المحلوق للذبيحة بالكحول بنسبة 70٪.
2. استخدم مشرطا معقما لإحداث شق خط المنتصف في البطن. إزالة الكبد والغدد الليمفاوية المساريقية والطحال والأمعاء الدقيقة من كل فأر باستخدام ملاقط معقمة.

3. تحليل الإزاحة البكتيرية

1. ضع كل عينة من الكبد والغدد الليمفاوية المساريقية والطحال في أنابيب معقمة مزينة مسبقا ووزنها. احسب وزن العينة على أنه الفرق بين وزن الأنبوب مع العينة ووزن الأنبوب الفارغ.
2. أضف PBS معقما إلى الأنبوب للحصول على تخفيف 1:10 (الوزن لكل حجم ، وزن / حجم) للعينة وتجانس كل عينة باستخدام مجانس معقم للأنسجة الزجاجية للحصول على تعليق متجانس.
3. قم بعمل تخفيفات متسلسلة (^10-1 إلى ^10-4) لكل عينة في PBS معقمة. صفيحة 0.1 مل من جميع مخففات كل نسيج على سطح ماكونكي و 5٪ أجار دم وأجار دم بروسيلا مع ألواح الهيمين (0.005 جم / لتر) وفيتامين K1 (0.01 جم / لتر).
4. احتضان لوحات ماكونكي و 5٪ من أجار الدم بشكل هوائي وألواح أجار الدم البروسيلا في ظروف لاهوائية عند 37 ^درجةمئوية.
5. عد مستعمرات البكتيريا الهوائية بعد 24 ساعة ، ومستعمرات البكتيريا اللاهوائية بعد 48 ساعة من الحضانة باستخدام عداد المستعمرة. التعبير عن النتائج كعدد وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) في غرام من الأنسجة.

النتائج

الشكل 1. تصميم الدراسة. تم علاج مجموعتين من الفئران (16 فئرا في كل مجموعة) عن طريق التزقيم الفموي باستخدام Bacillus subtilis BSB3 (مجموعة B. subtilis ) أو مع PBS (مجموعة PBS) مرتين في اليوم. في اليوم 3 ، تم تقسيم...

المواد