إنتاج وترسيب جراثيم العصيات الرقيقة على أساس الهباء الجوي

الملخص

المصدر: فوكس ، إف إم ، وآخرون. التحقيق في الآثار الضارة لتعقيم البلازما منخفض الضغط على بقاء جراثيم العصيات الرقيقة باستخدام المجهر الخلوي الحية. J. Vis. خبرة. (2017)

يوضح هذا الفيديو الإنتاج والتنقية والترسيب القائم على الهباء الجوي لجراثيم Bacillus subtilis لإنشاء طبقة أحادية موحدة ، مما يتيح التطبيقات النهائية مثل التحليل القائم على الفحص المجهري لإنبات الأبواغ أو الجدوى أو الاستجابة للإجهاد.

البروتوكول

1. إنتاج وتنقية بوغ Bacillus subtilis

1. لإنتاج الأبواغ ، قم بنقل مزرعة ليلية 5 مل من سلالة B. subtilis المعنية ، مع استكمال المضادات الحيوية المناسبة ، إلى 200 مل من وسط الأبواغ السائل Schaeffer مزدوج القوة (لكل لتر 16 جم مرق المغذيات ، KCl (كلوريد البوتاسيوم) 2 جم ، 0.5 جم MgSO₄ * 7 H₂O (كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات) ، 2 مل 1 م كالسيوم (NO₃) ₂ (نترات الكالسيوم) ، 2 مل 0.1 م MnCl₂ *• 4 H₂O (رباعي هيدرات كلوريد المنغنيز) ، 2 مل 1 ملي FeSO₄ (كبريتات الحديدوز) ، 2 مل 50٪ (وزن / حجم) جلوكوز 18) وزراعته بتهوية قوية عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة أو حتى > 95٪ من المزرعة تتكاثر. يتم استخدام جراثيم السلالات التالية: B. subtilis PY79 (النوع البري) B. subtilis PY79ΔrecA :: neo (نقص في بروتين إصلاح الحمض النووي RecA) B. subtilis PY79 recA-yfp :: cat (RecA مدمجة مع بروتين الفلورسنت الأصفر [YFP]).
2. حصاد الجراثيم عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 3,000 × جم في أنابيب 50 مل وتنقية العينات عن طريق خطوات الغسيل المتكررة (حتى 15 مرة) باستخدام H₂O المقطر المعقم والتحقق من النقاء وحالة الإنبات عن طريق الفحص المجهري التباين الطوري. تأكد من أن معلقات الأبواغ تتكون من جراثيم ساطعة الطور (> 99٪) وخالية من الخلايا الخضرية (القضبان) والجراثيم النابتة (المظهر الأسود / الرمادي) وحطام الخلايا ؛ خلاف ذلك ، يمكن إزعاج المزيد من التجارب المجهرية. اغسل العينة حتى الوصول إلى النقاء المطلوب.
3. حدد عيار الأبواغ عن طريق طلاء 50 ميكرولتر من التخفيفات التسلسلية بمقدار 10 أضعاف على LB (luria-bertani) -agar (على سبيل المثال: استخدم عينة 30 ميكرولتر + 270 ميكرولتر من الماء المعقم للتخفيف بنسبة 1:10. خذ 30 ميكرولتر من التخفيف المعين إلى 270 ميكرولتر H₂O لتخفيف 1: 100 وما إلى ذلك) لحساب CFU (وحدات تشكيل المستعمرة) واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد تحديد CFU ، اضبط العينة على 10⁹ جراثيم لكل مل عن طريق التركيز أو التخفيف بالماء المعقم.

2. تحضير عينة من جراثيم Bacillus subtilis المترسبة في الهباء الجوي

ملاحظه: قد يؤدي تراكم الجراثيم وتداخلها إلى تأثيرات تظليل أثناء العلاج ، مما يؤدي في النهاية إلى حركية تعطيل مزيفة. لتقليل هذه المشكلة ، قم بإعداد عينات من الأبواغ بتقنية ترسيب الهباء الجوي. باختصار ، تحكم في الفوهة عالية الدقة المكونة من مادتين باستخدام مؤقت كهربائي ينظم إنتاجية السائل بالتنسيق مع تدفق الغاز الناقل المضغوط (هنا N₂). قم بتفريق عينة السائل المحقون من خلال مخرج الفوهة باستخدام تدفق غاز النيتروجين.

1. ضع حامل عينة على شكل شرائح مجهرية معقمة (لحركية البقاء على قيد الحياة) أو أغطية مستديرة مقاس 25 مم (لتتبع الفلورسنت لعمليات إصلاح الحمض النووي / cLSM ؛ الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر) داخل وحدة رش الهباء الجوي التي تعمل بالكهرباء بمحاذاة مع الفوهة. يجب أن يتوافق تركيز الأبواغ المستخدم مع مائة ضعف من التركيز النهائي المطلوب.
2. انقل 1 مل من مزرعة الأبواغ إلى مدخل سائل الفوهة وابدأ عملية الرش بمقدار 0.1 ثانية عند ضغط 1.3 بار. يشكل تعليق البوغ المرشوش (1 × 10⁷) طبقة رقيقة على الشريحة المجهرية التي تجف بسرعة في غضون ثوان لتشكيل طبقة أحادية من الأبواغ موزعة بشكل موحد. قم بتخزين ناقلات العينة المعالجة في حاوية معقمة في درجة حرارة الغرفة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
فوهة من مادتين (موديل 970-8)	شليك	14,404	230 فولت ، 50 هرتز ، عمق 4.484 / 8 ، قطر التجويف 0.8 مم
لوريا برتاني وسط	سيجما ألدريتش	70122-100 جرام
موصلات الأنبوب	فيستو	غير متاح	ز 1/8
الشرائح الزجاجية	VWR	48300-026
غرفة خلية Attofluor	مينزل ، فيشر ريف.	3406816	د = 25 مم ، دائري
كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات	سيجما ألدريتش	13152
نترات الكالسيوم	سيجما ألدريتش	202967
كلوريد المنغنيز رباعي الهيدرات	سيجما ألدريتش	244589
كبريتات الحديدوز	تطبيق كيم	13446-34-9
الجلوكوز	ميرك	215422
كلوريد البوتاسيوم	سيجما ألدريتش	P9541-500G
مرق المغذيات (ملحوظة)	ميرك	105443
لوريا بيرتاني (رطل)	ميرك	110283
96 صفيحة بئر	ثيرموفيشر	243656