تحليل جدوى الكيسات الزنجارية الدقيقة باستخدام قياس التدفق الخلوي

الملخص

المصدر: تشابمان ، آي جيه ، وآخرون ، تحسين المسبار الجزيئي لتحديد وفيات الخلايا في كائن حي التمثيل الضوئي (Microcystis aeruginosa) باستخدام قياس التدفق الخلوي. J. Vis. خبرة. (2016)

يوضح هذا الفيديو طريقة التمييز بين خلايا Microcystis aeruginosa الحية والميتة من خلال الجمع بين وضع العلامات على مسبار الفلورسنت وتحليل قياس التدفق الخلوي للمضان الذاتي للفيكوسيانين وإشارة المسبار.

البروتوكول

1. تحسين امتصاص خلايا المسبار الجزيئي

1. احصد نصف مزرعة M. aeruginosa من مرحلة أسية واستخدمها كعنصر تحكم "حي".
   ملاحظة: قد تؤثر العينات المخففة من مزرعة عالية الكثافة مباشرة إلى مرحلة أسية على نتائج التحسين من خلال دوران الخلايا الميتة مقارنة بالثقافات الملقحة من مرحلة التأخر / الحث الأولي.
2. قم بإعداد النصف الآخر كعنصر تحكم "ميت" باستخدام طرق مثل 70٪ إيثانول ، أو تسخين العينات عند 60 ^درجةمئوية لمدة ساعة واحدة ، أو بارافورمالديهايد ، أو 4٪ فورمالديهايد لمدة 30 دقيقة. تحقق من الاختلافات في البيئة المكروية للعينات (على سبيل المثال ، الأس الهيدروجيني).
   ملاحظة: التحكم الإيجابي المقتل بالحرارة و "الميت" في M. aeruginosa يتميز عن عينة "حية" من خلال انخفاض إشارات الفيكوسيانين. قد لا يتسبب التسبب في الوفيات بطرق أخرى في نفس الناتج وسيختلف باختلاف الأنواع.
3. قم بإعداد عينات مختلطة باستخدام نسب مختلفة من العينات "الحية" و "الميتة" (على سبيل المثال ، 0٪ ، 25٪ ، 50٪ ، 100٪).
4. فصل تشكيل المستعمرة عن طريق الدوامة أو الصوتنة والتحقق من الأس الهيدروجيني.
5. حدد ليزر 488 نانومتر جنبا إلى جنب مع أجهزة الكشف التي يمكنها تسجيل التألق من مجسات الحمض النووي الخضراء (قناة التألق 1 أو FL1 ، 530 ± 15 نانومتر) والبرتقالية (قناة التألق 2 أو FL2 ، 585 ± 20 نانومتر) وليزر 640 نانومتر لتسجيل إشارات الفيكوسيانين من خلال الكاشف الخاص به.
   ملاحظة: عند ربطه بالحمض النووي ، يكون لمسبار الحمض النووي الأخضر طول موجة تحريض مضان تقريبي يبلغ 504 نانومتر وأقصى انبعاث يبلغ 523 نانومتر ، بينما يبلغ طول موجة الإثارة البرتقالي 547 نانومتر والحد الأقصى للانبعاث 570 نانومتر. يمكن استخدام ليزر الحالة الصلبة لأيون الأرجون 488 نانومتر لإثارة كلا المجسين الجزيئيين ، ومع ذلك ، فإن الليزر الأخضر (حتى 547 نانومتر) سينتج مضاغا برتقاليا أعلى.
6. كنقطة انطلاق ، أدخل المسبار الجزيئي بالتركيز الموصى به من الشركة المصنعة إلى 50٪ ثقافة "حية" و 50٪ "ميتة" واحتضان في الظلام.
7. حدد خلية بيانات جديدة ، ضع العينة أسفل منفذ إدخال العينة (SIP) مع العتبات والمشغلات التي ستقلل من ضوضاء الخلفية (FSC-H أو ارتفاع التشتت الأمامي ، 80,000).
8. قم بإنشاء مخطط كثافة باستخدام معلمات FSC-H و SSC-H (ارتفاع التشتت الجانبي) وثلاثة رسوم بيانية. رسم بياني واحد باستخدام قناة الكاشف البصري للمسبار الجزيئي المعني (FL1 أو 2) ، والآخر للكشف عن انبعاثات فيكوسيانين (ارتفاع القناة الفلورية 4 أو FL4-H) ، والآخر ، FSC-H ، كل ذلك على مقياس لوغاريتم.
9. احتضان عينات المتفطرة الزنجارية بمجسات الحمض النووي في الظلام لمدة تصل إلى 60 دقيقة ، والتسجيل في خلايا بيانات منفصلة في نقاط زمنية مختلفة (1 و 5 و 10 و 15 و 30 و 60 دقيقة).
   ملاحظة: عند ضبط المعلمات مثل الأس الهيدروجيني ، تحقق مع الشركات المصنعة لمعرفة التفاعلات المحتملة من مواد كيميائية معينة (بالنسبة لمجسات الحمض النووي المختبرة ، لا يمكن أن يحتوي المخزن المؤقت على الفوسفات أو مستويات عالية من الكاتيونات أحادية التكافؤ أو ثنائية التكافؤ ، حيث سيتم تقليل الارتباط بالحمض النووي).
10. قم بتطبيق بوابة برمجية لتضمين الرسم البياني FSC-H فقط (320,000 - 1,500,000) لحجم خلية الكائن الحي المستهدف في الرسم البياني لقناة مسبار التألق المعني.
    ملاحظة: كانت التركيزات المستخدمة في هذا البروتوكول 0.05 و 0.1 و 0.5 و 1 و 5 و 10 و 50 و 100 ميكرومتر ، والتي يمكن تغييرها إما عن طريق زيادة أو تقليل حجم عينة المتفطرة الزنجارية أو محلول المخزون الأولي للمجسات النووية.
11. في قناة مسبار التألق ، قم بتطبيق بوابة برمجية شاملة أخرى على أعلى قمة في الرسم البياني (أخضر FL1-H ، 240،000 - 1،650،000 ، برتقالي FL2-H ، 30،000 - 165،000) وبعد ذلك قم ببوابة هذا التألق الإيجابي في مخطط الكثافة.
12. قم بتشغيل الخطوات من 3.1 إلى 3.11 مع 100٪ "حي" و 100٪ "ميتة" وجميع عينات الاستزراع المختلطة ، وضبط تركيزات المسبار الجزيئي (على سبيل المثال ، × 0.1 إلى × 10) و / أو درجة الحرارة ومستويات الأس الهيدروجيني إذا لزم الأمر.
13. قارن عدد إشارات التألق الإيجابية للمسبار الجزيئي بكثافة الخلية الأصلية للخلايا "الميتة" (المأخوذة من نصف إجمالي FSC-H أو مزرعة "ميتة" بنسبة 100٪) للعثور على النسبة المئوية الإجمالية للخلايا الملطخة بمجسات الحمض النووي.
14. افعل ذلك لكل فترة زمنية داخل كل تركيز للعثور على البروتوكول الأمثل لأعلى نسبة من امتصاص المسبار النووي للخلية دون إنتاج تلطيخ غير محدد (استخدم الوسائل في تحليل أحادي الاتجاه للتباين أو ANOVA أو تحليل Kruskal-Wallis أحادي الاتجاه للتباين إذا كانت البيانات غير معلمية).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
البكتيريا الزرقاء وسائط	سيجما ألدريتش	ج3061-500 مل	BG-11 محلول مركز للمياه العذبة (تخفيف x50)
سائل إزالة التلوث	BD Biosciences	653155	تشغيل لمدة دقيقتين عندما تكون المخرجات أكثر من 12 حدثا في الثانية بسرعة أو معدل تدفق يبلغ 66 ميكرولتر / دقيقة. تليها دقيقتين من غمد H2O.
مقياس التدفق الخلوي	BD Biosciences	حسب الطلب	دينار بحريني أكوري C6
سيتوكس جرين	تقنيات الحياة	ط7020	صبغة الحمض النووي - محلول 5 ملي في DMSO
سيتوكس أورانج	تقنيات الحياة	س 11368	صبغة الحمض النووي - محلول 5 ملي في DMSO