تقييم النشاط المضاد للميكروبات لمتغيرات Nisin باستخدام مقايسة انتشار بئر أجار

الملخص

المصدر: نيكلينج ، جي إتش ، et.al. الببتيدات المضادة للميكروبات التي يتم إنتاجها عن طريق دمج الضغط الانتقائي للأحماض الأمينية غير القانونية. J. Vis. خبرة. (2018)

يوضح هذا الفيديو مقايسة انتشار بئر أجار المستخدمة لتقييم النشاط المضاد للميكروبات لمتغيرات النينسين. يوضح كيف أن Lactococcus lactis التي تعبر عن الببتيداز المرتبط بالغشاء NisP تنشط سلائف النيسين المنتجة في الإشريكية القولونية ، مما يؤدي إلى هالات تثبيط النمو. يعكس حجم هذه الهالات النشاط الحيوي لكل متغير من أنواع النسين.

البروتوكول

1. اختبار النشاط المضاد للميكروبات

1. تحضير ألواح GM17-agar في ظروف معقمة
   1. قم بإعداد مزرعة ليلية لسلالة المؤشر L. lactis NZ9000 التي تحمل البلازميد pNG nisPT عند 30 درجة مئوية في مرق M17 مع 1٪ (وزن / حجم) جلوكوز (= GM17) و 5 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول.
   2. قم بقياس_{OD 600} ، وقم بتلقيح الوسط الطازج إلى_{OD 600} = 0.1 واحتضن حتى OD₆₀₀ = 0.4-0.6. ثم ضع القارورة على الثلج.
      ملاحظه: كل قياس OD₆₀₀ سوف يستهلك حجم الثقافة. ضع في اعتبارك أنه لكل لوحة أجار مقايسة ، ستكون هناك حاجة إلى 1 مل من الثقافة البكتيرية. إذا لزم الأمر ، قم بزيادة حجم مزرعة السائل وفقا لذلك.
   3. للحصول على 1.5٪ أجار ، قم بوزن 4.5 جرام أجار في زجاجة وسائط زجاجية. أضف 300 مل ddH₂O ، واخلطها وأوتوكلاف.
   4. تحضير 2x مرق M17 (مركز مرتين) في 300 مل ddH₂O والأوتوكلاف.
   5. امزج 25 مل مرق 2x M17 يحتوي على 10 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول و 2٪ جلوكوز مع 1 مل من L . lactis قبل الاستزراع (4٪ حجم/حجمي).
   6. أضف 25 مل من أجار المصهور بنسبة 1.5٪ (معقم طازجا أو مسخن في الميكروويف).
      ملاحظه: قبل ذلك ، اترك الزجاجة تبرد عند لمسها (حوالي 50 درجة مئوية). هذا ضروري لأن L. lactis هو كائن حي mesophilic حساس لدرجات الحرارة المرتفعة.
   7. صب المحلول في طبق بتري كبير. جفف الأطباق لمدة 10-15 دقيقة.
   8. تعقيم نهايات ماصة باستور الزجاجية باللهب. انتظر حتى يبرد ، ثم استخدم الطرف العريض لعمل ثقوب في GM17-agar المتصلب.
2. تحضير العينة
   1. خذ 1 مل من بكتريا قولونية في أنبوب 1.5 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 3 دقائق عند 7,000 × جم. استنشق الوسط المتبقي وأعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر Na-P (50 ملي مولار من فوسفات الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 7.4 مصنوع من 0.5 مليون فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم و 0.5 M فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم).
   2. صوتنة العينات على الجليد. اغمر طرف مسبار الصوتة في تعليق الخلية. اضبط جهاز الصوتات على سعة 30٪ مع نبضة 1 ثانية وإيقاف التشغيل لمدة 3 دقائق.
   3. قم بالطرد المركزي للخلية المحللة لمدة 10 دقائق عند 13,000 × جم إلى حطام الخلية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب تفاعل جديد على الجليد.
   4. قم بتخفيف وتطبيع المواد الطافية المستخلصة للخلية إلى 1 مل OD₆₀₀ = 0.6 ، بالنسبة لكثافة الخلايا المحصودة ، باستخدام Na-P.
3. اختبار النشاط
   1. أضف 40 ميكرولتر من كل عينة طبيعية في ثقب في لوحة أجار المؤشر (الشكل 1). استخدم الكلورامفينيكول عند 400 ميكروغرام / مل كمركب تحكم مضاد للبكتيريا. استخدم المخزن المؤقت للشطف كعنصر تحكم سلبي. انتظر حتى يتم نشر جميع العينات في الأجار. احتضن الطبق طوال الليل عند 30 درجة مئوية.
   2. التقط صورا لألواح الأجار باستخدام ماسح ضوئي مسطح أو كاميرا رقمية. يمكن قياس أحجام هالة تثبيط النمو يدويا أو باستخدام ImageJ.

النتائج

الشكل 1. مقايسة النشاط المضاد للميكروبات لمحللات الخلايا التي تحتوي على متغيرات نيسين التي يتم إنتاجها عبر SPI مع نظائر البرولين. مقارنة بين متغيرات النيسين والعينات المؤتلفة من النوع البري. تم تطبيع جمي...

المواد