تحضير وسط بلغم اصطناعي لمحاكاة التليف الكيسي البلغم الرئوي خارج الجسم الحي

الملخص

المصدر: Vieira, J., et al. تصميم وتطوير نموذج لدراسة تأثير الأكسجين الإضافي على ميكروبيوم مجرى الهواء التليف الكيسي. J. Vis. خبرة. (2021).

يوضح هذا الفيديو تحضير وسط بلغم اصطناعي يحاكي اللزوجة وتكوين المغذيات ودرجة الحموضة في بلغم الرئة التليف الكيسي. يوفر الوسيط الناتج منصة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية للدراسات خارج الجسم الحي.

البروتوكول

1. تحضير متوسط البلغم الاصطناعي

ملاحظه: الكميات المدرجة هنا مخصصة لإنتاج 1 لتر من وسط البلغم الاصطناعي النهائي ، وتفترض الكواشف المحددة المدرجة في جدول المواد. يجب تعديل الأرقام لأحجام أخرى أو لاستخدام كواشف مختلفة لضمان نفس المنتج النهائي. انظر الجدول 1 للتركيزات المستهدفة.

1. المزيج الكيميائي للبلغم الاصطناعي (ASCM)
   ملاحظه: يشكل ASCM 25٪ من الحجم المتوسط النهائي. إنه مستقر على الرف ويمكن تحضيره بكميات كبيرة أو مسبقا. إذا كنت مستعدا للاستخدام لاحقا ، فقم بتعقيم المزيج الكيميائي وتخزينه بأمان في درجة حرارة الغرفة.
   1. امزج محاليل المخزون الكيميائي المكونة.
      1. تحضير 1 متر من مخزون كلوريد الصوديوم: أضف 58.44 جم من كلوريد الصوديوم لكل لتر من الماء المعقم.
      2. تحضير مخزون 1 متر KCl: أضف 74.55 جم من KCl لكل لتر من الماء المعقم.
      3. تحضير مخزون 1 م من MgSO₄ : أضف 246.47 جم من MgSO₄ · 7 ساعة₂O لكل لتر من الماء المعقم ، أو 120.37 جم من MgSO_{اللامائي 4} لكل لتر من الماء المعقم.
      4. تحضير 1 متر من مخزون الجلوكوز: أضف 180.16 جم من الجلوكوز لكل لتر من الماء المعقم.
   2. قم بتعقيم محاليل المخزون الكيميائي الأوتوكلاف ، بالإضافة إلى زجاجة فارغة سعة 250 مل. قم بتنفيذ خطوات التعقيم إلى قيم قياسية على الأقل تبلغ 121 درجة مئوية و 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 30 دقيقة.
   3. أضف 80.59 مل من الماء المعقم إلى الزجاجة الفارغة سعة 250 مل.
   4. أضف 152.30 مل من مرق 1 M من كلوريد الصوديوم إلى المزيج.
   5. أضف 15.8 مل من مرق 1 متر KCl إلى المزيج.
   6. أضف 610 ميكرولتر من مرق 1 M MgSO₄ إلى المزيج.
   7. أضف 700 ميكرولتر من مرق الجلوكوز 1 M إلى المزيج.
2. مزيج ميوسين البلغم الاصطناعي (ASMM)
   ملاحظه: تشكل ASMM 50٪ من الحجم المتوسط النهائي. تأكد من تحضيره في نفس يوم الدفعة المتوسطة النهائية.
   1. أضف 450 مل من الماء المعقم إلى زجاجة فارغة سعة 1 لتر.
   2. أضف 50 مل من محلول ملحي 10x فوسفات (PBS) إلى الزجاجة.
   3. أضف قضيب تحريك مغناطيسي يمكن التخلص منه إلى الزجاجة.
   4. قم بتعقيم الزجاجة التي تحتوي على PBS وشريط التحريك.
   5. قم بقياس 10 جم من مسحوق الميوسين وأضفه إلى PBS.
   6. رج الزجاجة بقوة للخلط الأولي.
   7. ضع الزجاجة على طبق ساخن باستخدام محرك مغناطيسي. اضبطي الحرارة على درجة حرارة متوسطة إلى عالية ، مع استهداف 50 درجة مئوية وسرعة التقليب إلى 1100 دورة في الدقيقة. ارفع السرعة تدريجيا حتى لا يطير الشريط من المغناطيس.
      1. اتركيه يسخن ويقلب لمدة 15 دقيقة.
      2. التقط الزجاجة بقفازات مقاومة للحرارة. راقب للتحقق مما إذا كان مسحوق الميوسين يستقر خارج المحلول.
      3. إذا لم يذوب مسحوق الميوسين تماما ، أعد الزجاجة إلى الحرارة / المحرك لمدة 5 دقائق حتى تذوب تماما.
   8. اترك مزيج الميوسين يبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة.
3. المزيج البيولوجي للبلغم الاصطناعي (ASBM)
   ملاحظه: ASBM هو 25٪ من الحجم المتوسط النهائي. قم بإعداده في نفس يوم الدفعة المتوسطة الأخيرة ، وعلى عكس الخلطات الأخرى ، لا تعرض مكوناته لأي حرارة.
   1. قم بإذابة مرق الفيتامينات 100x في ثلاجة 4 درجات مئوية أو على الثلج. ​
      ملاحظه: قم بتقسيم مخزون الفيتامينات مسبقا إلى 10 مل لتقليل عدد دورات التجميد / الذوبان.
   2. أضف 124.24 مل من الماء المعقم إلى الزجاجة الفارغة المعقمة سعة 250 مل.
   3. أضف 25.76 مل من مخزون الأحماض الأمينية الأساسية 50x إلى المزيج.
   4. أضف 80.14 مل من مخزون الأحماض الأمينية غير الأساسية 100x إلى المزيج.
   5. أضف 10 مل من مرق الفيتامينات (المذاب) 100x إلى المزيج.
   6. أضف 1 مل من مخزون المعادن النزرة 1000x إلى المزيج.
   7. أضف 8.33 مل من مستحلب صفار البيض بنسبة 30٪ إلى المزيج.
   8. أضف 400 ميكرولتر من مرق الفيريتين 10 جم / لتر إلى المزيج.
   9. امزج المحلول جيدا عن طريق الرج اليدوي.
4. وسط البلغم الاصطناعي (ASM)
   1. أضف 250 مل من ASCM إلى الزجاجة سعة 1 لتر التي تحتوي على ASMM.
   2. أضف 250 مل من ASBM إلى الزجاجة المتوسطة.
   3. قم بمعايرة الوسيط باستخدام المخزن المؤقت الأساسي MOPS (1 M) للوصول إلى درجة حموضة 6.3 على ورق الأس الهيدروجيني ذي النطاق الضيق. قبل المعايرة بالتحليل الحجمي ، سيكون المزيج المتوسط حمضيا جدا.
   4. ضعي وسط البلغم الاصطناعي الناتج في الثلاجة عند 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للترشيح.
   5. لبدء عملية الترشيح ، انقل 200 مل من وسط البلغم الاصطناعي غير المصفى إلى نظام ترشيح فراغ مع مرشح بحجم المسام 0.22 ميكرومتر.
   6. قم بتوصيل نظام الترشيح بمضخة التفريغ ، وقم بتشغيل مضخة التفريغ ، واضبطها على 70 ملي بار ، ثم ضع الغرفة على شاكر مداري يهتز عند 90 دورة في الدقيقة في غرفة باردة عند 4 درجات مئوية.
      1. قم بتزيين 150 مل إضافية من الوسط ، حيث يتم تصفية كمية كبيرة. يستغرق تصفية 1 لتر من الوسط تماما من 1 إلى 2 يوم.
      2. كرر مع غرف إضافية حتى يتم تصفية جميع الوسائط.
         ملاحظه: حاول ألا تقوم بتصفية أكثر من 350 مل من الوسط من خلال نفس مرشح 0.22 ميكرومتر لأن الميوسين سيقوم بتوصيل الفلتر بمرور الوقت.
   7. ضعي البلغم الاصطناعي المصفى في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام. استخدم ASM في غضون شهر واحد من التحضير للحصول على أفضل النتائج.

الجدول 1: وصفة وسط البلغم الاصطناعي المستمدة من مراجعة الأدبيات. (العمود 1) الكواشف والقيم الرئيسية في صياغة وسط البلغم الاصطناعي. (الأعمدة 2-7) مقارنة الوصفات من الأدب الموجود. (الأعمدة 8-9).

العمود 1		العمود 2	العمود 3	العمود 4	العمود 5	العمود 6	العمود 7	العمود 8	العمود 9
قيمة		كومستوك	كيرتشنير	سريرامولو	بالمير	فلين	غالاغير	لاي	مصدر
الميوسين		2٪ وزنا/حجما	0.5٪ وزن / حجم	0.5٪ وزن / حجم	-	1٪ وزن / حجم	2٪ وزنا/حجما	1٪ وزن / حجم	فلين
كلوريد الصوديوم		85.5 مم	85.5 مم	85.5 مم	66.6 ملي	89.8 ملي	85.5 مم	152.3 ملي	لابيير
كلوريد البوتاسيوم		29.5 ملي	29.5 ملي	29.5 ملي	15.8 ملي	-	2.95 ملم	15.8 ملي	بالمير
كبريتات المغنيسيوم		-	-	-	0.6 ملي	1 ملي	1 ملي	0.61 ملي	بالمير
كبريتات الحديد		-	-	-	0.0036 مم	-	-	-	-
كلوريد الأمونيوم		-	-	-	2.3 ملي	60 ملي	-	-	-
فوسفات أحادي البوتاسيوم		-	-	-	2.5 ملي	60 ملي	-	-	-
الجلوكوز		-	-	-	3.2 ملي	13 ملي	40 ملي	0.7 ملم	سامبيك
اللاكتات		-	-	-	9 ملي	-	-	-	-
الأحماض الأمينية الأساسية		14.45 ضعفا	0.25 جم / لتر	0.25 جم / لتر	لكل حمض	0.5x	0.375 ضعف	1.29 ضعف	بالمير
الأحماض الأمينية غير الأساسية		28.9 ضعفا	0.25 جم / لتر	0.25 جم / لتر	لكل حمض	0.25x	0.5x	8.01 ضعف	بالمير
فيتامينات		-	-	-	-	-	1x	1x	غالاغير
المعادن النادرة		-	-	-	-	1x	1x	1x	فلين
صفار البيض		0.25%	0.25%	0.25%	-	-	0.25%	0.25%	كيرتشنير
الفيريتين		0.0003 جم / لتر	-	-	-	-	0.0004 جم / لتر	0.0004 جم / لتر	غالاغير
الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون		1.4 جم / لتر	4 جم / لتر	4 جم / لتر	-	-	1.4 جم / لتر	-	-
دبتا		-	-	0.0059 جم / لتر	-	-	-	-	-
الرقم الهيدروجيني		-	6.9	-	6.8	-	-	6.3	لابيير
خزن		0	4°	-	-	4°	4°	4°	كيرتشنير
تعقيم		الأوتوكلاف	راووق	الأوتوكلاف	-	الأوتوكلاف	الأوتوكلاف	راووق	كيرتشنير

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
محلول فيتامينات BME (100x)	ميليبورسيجما	ب6891	محلول مركز من الفيتامينات التكميلية.
مكشكش، 30 مم	DWK علوم الحياة	224307	مكشكش لربط أختام الألومنيوم بزجاجات المصل.
د- (+) - جلوكوز	ميليبورسيجما	جي 7021	مسحوق الجلوكوز الصلب (أيزومر ديكستروراتوري).
مضخة الحجاب الحاجز ME 2 NT	فاكوبراند	20730003	مضخة فراغ لترشيح الفراغ.
مستحلب صفار البيض	هاي ميديا	FD045	مستحلب معقم 30٪ صفار بيض في محلول ملحي.
الفيريتين ، موجبة من طحال الحصان	ميليبورسيجما	إف 7879	محلول الفيريتين (بروتين تخزين الحديد).
FIREBOY بالإضافة إلى سلامة بنسن الموقد	إنتجيرا بيوساينسز	144000	شعلة بنسن مع واجهة مستخدم وميزات أمان.
ورق هيدريون الأس الهيدروجيني (1.0-14.0)	مختبر مايكرو اسنشال	94	ورق اختبار الأس الهيدروجيني لنطاق 1.0-14.0.
ورق Hydrion pH (4.0-9.0)	مختبر مايكرو اسنشال	55	ورق اختبار الأس الهيدروجيني لنطاق 4.0-9.0.
ورق هيدريون الأس الهيدروجيني (6.0-8.0)	مختبر مايكرو اسنشال	345	ورق اختبار الأس الهيدروجيني في نطاق 6.0-8.0.
جهاز أمان تحت الجلد نيدل برو إيدج، 18 جرام	سميث ميديكال	401815	إبر 18 جرام مع أغطية أمان.
مقياس الضغط في الخط	ميليبورسيجما	20469	مقياس ضغط الغاز لمراقبة ضغط الزجاجة.
Innova 42 شاكر محتضن	إيبندورف	2231000756	حاضنة مركبة / شاكر مداري.
حقنة Luer-Lok مع إبرة متصلة	بيكتون ديكنسون	309580	مزيج حقنة 3 مل وإبرة 18 جم.
تشكيلة صمام لور	الأدوات الدقيقة العالمية	14011	صمامات لأنابيب تدفق الغاز.
شاكر LSE المداري	ثيرموفيشر العلمية	6780-NP	شاكر مداري لتحريك الوسائط أثناء الترشيح.
كبريتات المغنيسيوم سباعي	ميليبورسيجما	إم 2773	ملح إبسوم صلب (كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدرات).
منظم هواء طبي أحادي المرحلة مع مقياس الجريان	ويسترن إنتربرايزز	M1-346-15FM	منظم معدل تدفق الهواء بمتر 15 لتر / دقيقة.
محلول الأحماض الأمينية MEM (50x)	ميليبورسيجما	إم 5550	محلول مركز من الأحماض الأمينية الأساسية.
محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100x)	ميليبورسيجما	م 7145	محلول مركز من الأحماض الأمينية غير الأساسية.
مرشح Millex-GP ، 0.22 ميكرومتر	ميليبورسيجما	SLMP25SS	0.22 ميكرومتر مرشح حقنة معقمة غشاء البولي إيثر سلفون.
ميلي كيو أكاديمي	ميليبورسيجما	ZMQS60E01	نظام تنقية المياه المعقمة Milli-Q.
جهاز مراقبة الأكسجين MiniOX 3000	الفصحى	814365	مراقب نسبة الأكسجين لتدفق الغاز.
المخزن المؤقت MOPS (1 م، الرقم الهيدروجيني 9.0)	بوسطن بيو برودكتس	بي بي إم -90	مخزن مؤقت MOPS لضبط درجة الحموضة في الوسائط.
موسين من معدة الخنازير	ميليبورسيجما	م 2378	مسحوق الميوسين (بروتين مكون للهلام الغليكوزيلات).
كلوريد البوتاسيوم	ميليبورسيجما	ص 9541	ملح كلوريد البوتاسيوم الصلب.
PTFE قضبان التحريك القابل للتصرف	ثيرموفيشر العلمية	14-513-95	قضبان التحريك المغناطيسية التي تستخدم لمرة واحدة.
PTFE الموضوع ختم الشريط تفلون	VWR	470042-938	شريط تفلون لتقوية توصيلات نظام الغاز.
خرطوشة تنقية Q-Gard 2	ميليبورسيجما	QGARD00D2	خرطوشة تنقية لنظام Milli-Q.
زجاجات تخزين الوسائط القابلة لإعادة الاستخدام	ثيرموفيشر العلمية	06-423 أ	زجاجات لخلط وتخزين وسائط الاستزراع.
سدادة مطاطية، 30 مم، بروموبوتيل رمادي	DWK علوم الحياة	224100-331	سدادات مطاطية لزجاجات المصل.
زجاجة مصل مع تخرج مصبوب ، 500 مل	DWK علوم الحياة	223952	زجاجات مصل زجاجية للزراعة المختومة.
مجموعة تمديد التجويف الصغيرة	براون الطبية	471960	تمديد الأنابيب مع موصلات قفل لوير.
كلوريد الصوديوم	ميليبورسيجما	ط3014	ملح كلوريد الصوديوم الصلب.
خليط المعادن النزرة، 1000x	ثيرموفيشر العلمية	NC0112668	محلول مركز من المعادن النزرة الفسيولوجية.
ختم ألومنيوم غير مبطن ، 30 مم	DWK علوم الحياة	224187-01	أختام الألومنيوم مجعد فوق سدادات المطاط.