القياس الكمي للوحدات المكونة للمستعمرة للبكتيريا المرتبطة بالقناة الهضمية في ذبابة الفاكهة

الملخص

المصدر: دودج ، ر. ، وآخرون. عد وحدة تشكيل مستعمرة سريعة في شكل لوحة 96 بئرا مطبقة على ذبابة الفاكهة الميكروبيومية. J. Vis. خبرة. (2023)

يوضح هذا الفيديو التقدير الكمي لوحدات تكوين المستعمرة (CFUs) للبكتيريا المرتبطة بالأمعاء في ذبابة الفاكهة باستخدام نهج التخفيف والطلاء التسلسلي. يتم تخفيف عينات الذباب المتجانسة التي تحتوي على بكتيريا الأمعاء بشكل متسلسل ، ومطلية بالأجار ، واحتضانها للسماح بنمو المستعمرة. ثم يتم تحليل صور اللوحات باستخدام برنامج لمحاذاة المستعمرات وتقسيمها وعدها في كل بقعة ، مما يتيح القياس الكمي الدقيق ل CFU.

البروتوكول

1. تجانس الذباب بشكل فردي في لوحة PCR 96 بئر

1. تحضير لوحات الخافق مسبقا.
   1. صب حبات زجاجية 0.5 ميكرومتر (انظر جدول المواد) على صينية قياس الخرز. انشر الخرزات على الدرج بحيث تكون جميع الآبار ممتلئة ومستوية ، ثم قم بتنظيف الخرزات الزائدة في أنبوب مخروطي لاستعادتها.
   2. ضع لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الحواف (PCR) (انظر جدول المواد) رأسا على عقب على صينية القياس وقم بمحاذاتها مع الآبار عن طريق تركيبها في المسافة البادئة الموجودة على الدرج. ثم اقلبها بسرعة لنقل الخرز.
   3. قم بإزالة الخرزات الزائدة من سطح لوحة PCR وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم. افحص لوحة PCR للتأكد من أن جميع الآبار تحتوي على خرز. استخدم مغرفة وزن إذا لزم الأمر لإضافة الخرز إلى بئر واحد. إذا تسببت الكهرباء الساكنة في التصاق الخرز بأسطح اللوحة ، فامسح أو رش الجزء الخلفي من صينية القياس ولوحة PCR بنسبة 70٪ إيثانول.
   4. غطيها بورق الألمنيوم. يمكن تحضير العديد من اللوحات بهذه الطريقة ثم تعقيمها وتخزينها لاستخدامها لاحقا. عندما تكون جاهزا للاستخدام، أضف 100 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) إلى كل بئر باستخدام الماصة ذات 96 قناة (انظر جدول المواد).
2. تعقيم الذباب المستعمر بالميكروبات بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل التجانس.
   1. قم بتخدير الذباب بنسبة 100٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 5 ثوان. انقل الذباب المخدر من القارورة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل باستخدام قمع صغير (الشكل 1A-2). في هذه الدراسة ، تمت إضافة 25 ذبابة عادة لكل أنبوب.
   2. رش على الفور ~ 1 مل من 70٪ إيثانول في الأنبوب ، وأغلق الأنبوب ، واخلطه عن طريق الانعكاس لمدة 10 ثوان. بعد ذلك ، استنشق الإيثانول باستخدام ماصة P1000 ، مع الحرص على عدم شفط أي ذباب. كرر مرة أخرى باستخدام الإيثانول ، ثم مرتين باستخدام PBS المعقم (الشكل 1A-3).
3. بعد غسل PBS النهائي ، أغلق الأنبوب ، ومع وضع جانب الغطاء لأسفل ، اضغط عليه بقوة عدة مرات على المقعد حتى يدخل الذباب في الغطاء.
4. افتح الأنبوب ووزع الذباب في الآبار باستخدام الملقط (الشكل 1A-4). ضع ذبابة واحدة في كل بئر (الشكل 1A-5). احتفظ بالطبق على الثلج أثناء التحميل للحفاظ على تخدير الذباب.
5. أغلق اللوحة باستخدام رقائق مانعة للتسرب بالحرارة Thermal Bond (انظر جدول المواد).
   1. أولا ، قم بإزالة أي حبات طائشة قريبة من الآبار ، لأنها يمكن أن تسبب تسربا في ختم الرقائق. تأكد من أن الجانب الباهت من الرقاقة موجه لأسفل على اللوحة والجانب اللامع لأعلى باتجاه مانع التسرب الحراري. اضغط على مانع التسرب الحراري (انظر جدول المواد) لأسفل بقوة لمدة 5 ثوان (الشكل 1A-6). قم بتلميع أداة التطبيق اليدوية (انظر جدول المواد) لتأمين ورق القصدير.
      ملاحظة: الختم السيئ هو سبب فقدان العينة.
6. قم بتأمين اللوحة في شاكر اللوحة. تجانس لمدة 5 دقائق (الشكل 1A-7). قم بتدوير لوح الخرزة لأسفل لمدة 30 ثانية في آلة دوار صغيرة (انظر جدول المواد) عند 350 × جم لإزالة السائل من رقائق الختم.
7. قم بإزالة ورق القصدير أثناء الإمساك باللوحة حتى لا تتناثر قطرات الذباب المتجانسة من الآبار.

2. التخفيف التسلسلي من ذبابة متجانسة واكتشاف على لوحات CFU

1. ضع أربع ألواح مستطيلة لنمو أجار دي مان وروجوسا وشارب (MRS) (انظر جدول المواد) في خزانة السلامة الحيوية وقم بإزالة أغطيتها. في هذا البروتوكول ، تم استخدام أجار MRS لنمو L. بلانتاروم. اترك هذه الأطباق لتجف لمدة 10 دقائق على الأقل (20 دقيقة إذا تم سكبها طازجا أو باردة من التخزين).
   ملاحظة: إذا كانت الألواح مبللة ، فسوف تعمل القطرات من اللوحة المكونة من 96 بئرا معا وتدمر الأعداد.
2. قم بإعداد ثلاث ألواح تخفيف عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر من صفيحة معقمة ذات 96 بئرا باستخدام ماصة ذات 96 قناة. قم بتحميل حامل من أطراف P20 على الماصة ذات 96 قناة.
3. قم بعمل تخفيف 1:10 عن طريق شفط 11.1 ميكرولتر من المتجانس من لوحة العينة المعدة في القسم 1 (الشكل 1 أ -8). تأكد من الرسم من منتصف الآبار بدلا من قاع الآبار لأن الذبابة تتجانس والخرز الزجاجي سوف يسد الماصات. تغرق الخرزات ، وتطفو جزيئات الذبابة ، تاركة الطبقة الوسطى واضحة في الغالب.
4. قم بتوزيع 11.1 ميكرولتر في لوحة التخفيف الأولى ، والتي تحتوي بالفعل على 100 ميكرولتر من PBS المعقمة لكل بئر. احتفظ بلوحة التخفيف على شاكر اللوحة لمدة 10 ثوان عند 600 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة). امزج مرة أخرى عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل لمدة خمس دورات. انقل 11.1 ميكرولتر من لوحة التخفيف الأولى إلى لوحة التخفيف الثانية ، وكرر خطوات الخلط للوحين التخفيف التاليين.
5. قم بإجراء طلاء سلسلة التخفيف كما هو موضح أدناه.
   1. استرجع ألواح النمو من خزانة السلامة الحيوية.
   2. بدءا من اللوحة الأكثر تخفيفا ، ضع 2 ميكرولتر من كل بئر على ألواح الأجار باستخدام الماصة ذات 96 بئرا (الشكل 1A-9).
      1. اخفض رأس الماصة ببطء على اللوحة ، مع الحرص على عدم الطعن في الأجار. افحص اللوحة بعناية وتأكد من الاستغناء عن جميع البقع ؛ إذا لم يكن الأمر كذلك ، أضف 2 ميكرولتر يدويا إلى الموضع المناسب. تأكد من أن البقع السائلة تنقع بسرعة في الأجار ولا تعمل معا.
      2. إذا كانت البقع تعمل معا ، فقم بتجفيف مجموعة جديدة من ألواح الأجار الطازجة لفترة أطول وأعد الإكتشاف. إذا كان هناك أنواع متعددة من الألواح (على سبيل المثال ، وسائط مختلفة أو مع المضادات الحيوية) ، فاكتشفها أيضا. قم بتوزيع أي محلول متبقي مرة أخرى في لوحة التخفيف وانتقل إلى التركيز العالي التالي.
         ملاحظة: عند اكتشاف التخفيفات، امزج التخفيف التالي خمس مرات للتأكد من إزالة محتويات أطراف الماصة من التخفيف السابق. يمكن تخزين ألواح التخفيف لمدة >8 ساعة عند 4 درجات مئوية دون التأثير على عدد المستعمرات.
6. كرر عملية الطلاء كما هو موضح في الخطوة 2.5 لألواح التخفيف المتبقية ، وتتقدم من الأكثر تخفيفا إلى الأكثر تركيزا حتى تتجانس اللوحة الأصلية.
7. عندما يتم امتصاص كل السائل في الأجار ، اقلب الألواح وضعها في الحاضنة (الشكل 1A-10). بالنسبة إلى Lactiplantibacillus و Acetobacter من ذبابة الفاكهة ، فإن درجة الحرارة المثلى هي 30 درجة مئوية على وسائط MRS. احتضن حتى تصل المستعمرات إلى الحجم الأمثل: المستعمرات كبيرة بما يكفي لرؤيتها بوضوح ولكنها ليست كبيرة جدا بحيث تندمج أو تتداخل مع نمو بعضها البعض (انظر النتائج التمثيلية لقياس الحجم الأمثل).
   ملاحظة: تعتمد ظروف النمو المثلى على الإجهاد ويجب تحديدها تجريبيا. بالنسبة إلى Lactiplantibacillus من ذبابة الفاكهة ، فإن الوقت الأمثل للحضانة هو 26 ساعة إلى 30 ساعة على MRS agar. بالنسبة للأسيتوباكتر من ذبابة الفاكهة ، فإن الوقت الأمثل للحضانة هو 30 ساعة إلى 48 ساعة على MRS ، اعتمادا على السلالة.
8. بعد الحضانة ، قم بتخزين الألواح في درجة حرارة 4 درجات مئوية إذا لزم الأمر حتى تصبح جاهزة للعد.

3. القياس الكمي لوحدات تشكيل المستعمرة (CFUs)

1. تحديد CFUs عن طريق تصوير اللوحات ومن ثم عد المستعمرات باستخدام البرامج الآلية, كما هو مفصل أدناه. إذا تم تخزين الألواح عند 4 درجات مئوية ، فاسمح لها أولا بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة حتى لا يكون هناك تكاثف على الألواح ، مما ينتج عنه وهج.
2. قم بتنظيم اللوحات في تسلسل منطقي واحتفظ بها بهذا الترتيب أثناء التصوير - فهذا يجعل من السهل تسمية الملفات. قم بتوجيه جميع اللوحات بحيث يكون A1 في الزاوية اليسرى العليا لجميع الألواح. يوصى بتسمية زاوية A1 بمعرف فريد لضمان عدم خلط الصور. قم بتكديس كل سلسلة تخفيف بالترتيب.
3. قم بإزالة غطاء اللوحة وضع اللوحة على المسرح مع توجيه A1 في الزاوية الصحيحة. تم تحسين صندوق صور اللوحة لتصوير لوحات الدرج هذه ويتضمن خيارات الإضاءة والفلتر لتصوير مستعمرات الفلورسنت.
4. صور اللوحات. استخدم الكاميرا (انظر جدول المواد) مع الإعدادات اليدوية لتحقيق مستوى تعريض ضوئي ثابت بين الألواح. يوصى بإعداد البعد البؤري الطويل لتقليل تشوه المنظور. التقط الصورة باستخدام غالق عن بعد لتقليل الضبابية الناتجة عن اهتزاز الكاميرا.
5. انقل الصور إلى جهاز كمبيوتر وأعد تسميتها ، بما في ذلك اسم التجربة ونوع الوسائط وعامل التخفيف وأي تفاصيل أخرى ذات صلة. تحتوي بعض أنظمة التشغيل (راجع جدول المواد) على ميزة مفيدة لإعادة تسمية الدفعات في Finder عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على مجموعة مختارة من الملفات.

4. العد الآلي للمستعمرات باستخدام مجموعة Count-On-It

1. قم بقص الصور باستخدام المكون الإضافي Croptacular المتوفر ل ImageJ. يساعد هذا المكون الإضافي على تقسيم الصورة إلى مجموعة منظمة من المناطق الفرعية (على سبيل المثال ، 8 × 12 للوحة ذات 96 بئرا). سيتم حساب المناطق الفرعية بشكل فردي.
   1. قم بتنظيم الصور المراد معالجتها لقياسها كميا في مجلد. اختر أسماء الملفات التي تميز اللوحات، حيث تصبح أسماء الملفات هذه عناوين أعمدة لكل مجموعة من الأعداد. داخل هذا المجلد ، قم بإنشاء مجلدات فرعية باسم "اقتصاص" و "إيصالات".
   2. قم بتشغيل Croptacular ، وانقر فوق "موافق" لبدء الاقتصاص.
      ملاحظة: يتم عرض الإعدادات الافتراضية وعادة ما تكون كافية. اعتمادا على دقة الصورة والإضاءة وحجم البقعة وما إلى ذلك ، قد يكون من المفيد ضبط المعلمات الأساسية.
   3. إذا كانت الصورة مستقيمة بالفعل ، فما عليك سوى الضغط على مسافة. خلاف ذلك ، قم بتصويب الصورة عن طريق رسم خط على طول حافة يجب أن تصبح أفقية. أعد رسم الخط عدة مرات حسب الحاجة إذا كانت الصورة لا تزال غير مستقيمة.
   4. بعد ذلك ، ارسم مربعا حدوديا للمنطقة التي يجب إجراء العد لها. اضبط الحجم والنسبة حتى تصبح جميع البقع داخل خلاياها. اسحب المؤشر خارج مربع الحدود لتحديث الشبكة. عندما تبدو الشبكة جيدة، اضغط على مسافة.
   5. تأكد من أن الصورة التالية تدور تلقائيا إلى نفس زاوية الصورة الأولى ؛ يفترض المكون الإضافي أن جميع الصور محاذاة بنفس الطريقة. إذا كان ذلك دقيقا، فاضغط على مسافة للمتابعة. خلاف ذلك ، قم بتصويب الصورة كما كان من قبل. تستدعي الشبكة أيضا نفس موضع الصورة السابقة. اضبط إذا لزم الأمر، ثم اضغط على Space.
2. تعداد المستعمرات الموجودة على اللوحات باستخدام المكون الإضافي Count-On-It: Gridiron المتوفر ل ImageJ.
   1. قم بتشغيل Count-On-It > Gridiron. استخدم نفس إعدادات الشبكة كما هو الحال مع Croptacular. يمكن للمستخدمين تجميع مجلد كامل أو تحليل صورة واحدة أو البدء من الصورة الحالية.
   2. قم بتعيين الحد استنادا إلى قيمة كثافة البكسل العليا والسفلية. اجعل العتبة صارمة قدر الإمكان مع الاستمرار في تحديد جميع المستعمرات. من الناحية المثالية ، سيكون هناك بعض المساحة بين المستعمرات المحددة ، لكن البرنامج قادر على تقسيم الكائنات الثنائية إلى حد ما. انقر فوق موافق في مربع الحوار "الإجراء المطلوب" عندما يكون الحد مرضيا.
   3. لفحص النتائج، قم بالتكبير والنظر عن كثب إلى عدد المستعمرات. سيؤدي النقر فوق إلغاء إلى إجهاض المكون الإضافي. انقر فوق موافق للمتابعة.
   4. في الصورة الأولى ، تأكد من إعطاء خيار المتابعة أو العودة إلى قائمة الإعداد ، على سبيل المثال ، لتغيير الحد الأدنى لحجم المستعمرة. لمتابعة عملية الدفعة ، انقر فوق موافق. بعد ذلك، حدد مجلدا للاحتفاظ بجدول الإيصالات والنتائج. استخدم مجلد "الإيصالات" أو أنشئ مجلدا جديدا.
   5. بعد الصورة الأولى ، سيتم تعيين الصور التالية افتراضيا إلى نفس الحد مثل الإعدادات السابقة. انقر فوق موافق لاستخدام هذه الإعدادات أو ضبط الإعدادات. إذا كانت الصور متسقة وكان الإعداد دقيقا ، فانقر فوق "موافق" في مربع الحوار "الإجراء المطلوب".
      ملاحظة: بمجرد اكتمال كافة الصور الموجودة في الدفعة، يتم حفظ جدول النتائج تلقائيا في نفس المجلد مثل الإيصالات.
   6. راجع إيصالات العد التي ينتجها البرنامج وتصحيح أي أخطاء في العد يدويا. المكون الإضافي ImageJ دقيق إحصائيا، ولكن تحدث أخطاء. إثبات الإيصالات لفحص القيم المتطرفة وتحديد الأخطاء في التهم. يحفظ البرنامج بيانات CFU كملف .csv في نفس المجلد مثل الإيصالات.
3. تحليل البيانات باستخدام البرنامج المفضل للمستخدم.

النتائج

الشكل 1: يقيس اختبار الاستعمار CFUs في مئات الذباب الفردي باستخدام تنسيق لوحة 96 جيدا. (أ) نظرة عامة تصويرية لمقايسة الاستعمار وطريقة القياس الكمي عالية الإنتاجية المستخدمة كما هو موضح في قسم البروتوكول. (ب) ت...

المواد