علاج البكتيريا بإفرازات جذر النبات لمحاكاة تفاعلات النبات والميكروبات في المختبر

الملخص

المصدر: Yi, Y., et al. تفاعل النبات والميكروب: الاستجابة النسخية ل Bacillus mycoides لإفرازات جذر البطاطس. J. Vis. خبرة. (2018)

يوضح هذا الفيديو تحضير وعلاج مزارع الفطريات Bacillus لدراسة تفاعلات النبات والميكروب. يحدد الخطوات من خطوط ثقافة المخزون واحتضانها في وسط سائل إلى تعريض البكتيريا لإفرازات جذور النبات تحت التحريض. تبلغ العملية ذروتها في حصاد الخلايا البكتيرية وتجميدها السريع لتحليلها اللاحق لتغيرات التعبير الجيني الناتجة عن الإفرازات.

البروتوكول

1. زراعة البكتيريا

1. قم بوضع سلالة B. mycoides من مخزون الجلسرين -80 درجة مئوية على صفيحة أجار Luria-Bertani (LB) ، واحتضن اللوحة عند 30 درجة مئوية طوال الليل.

2. قم بتلقيح وسط سائل LB بمستعمرة واحدة من اللوحة ، وقم بتنمية الثقافة في حاضنة اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة طوال الليل في
30 درجة مئوية.

2. علاج وأخذ عينات من البكتيريا

1. لمقارنة منحنى نمو البكتيريا المعالجة بإفرازات الجذور بعنصر تحكم سلبي ، قم بإعداد سلسلة من القوارير التي تحتوي على 50 مل من وسط سائل LB. أضف 0.5 مل من المزرعة البكتيرية الليلية إلى جميع القوارير ، وأضف إما إفرازات الجذر 0٪ أو 5٪ أو 10٪ أو 15٪ (حجمي / حجمي) أو الماء معقم منزوع الأيونات إلى الوسط ، على التوالي.

2. استخدم ثقافة بالماء منزوع الأيونات بدلا من إفرازات الجذور كعنصر تحكم. قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) كل 1 ساعة بعد ذلك. قم بإنشاء منحنى نمو عن طريق رسم قيم OD₆₀₀ مقابل الوقت.

3. قم بتخفيف مزرعة B. mycoides بين عشية وضحاها ب 90 مل من وسط LB المسخن مسبقا إلى OD₆₀₀ أولي ~ 0.05 في قارورة 300 مل. أضف 10 مل من إفرازات الجذور إلى المزرعة واحتضنها عند 30 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

4. استخدم معالجة المياه منزوعة الأيونات المعقمة 10 مل كعنصر تحكم. اجمع الخلايا من المزرعة عن طريق الطرد المركزي عند 9,000 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، وقم بتجميد الحبيبات على الفور في النيتروجين السائل ، ثم قم بتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
هيبوكلوريت الصوديوم	سيغما	سجل المستخلصات الكيميائية: 7681-52-9	10-15٪ كلور نشط
مرق لوريا بيرتاني (رطل)
حاضنة	نيو برونزويك العلمية	إنوفا 4000
مقياس الطيف الضوئي	ثيرمو فيشر العلمي	جينيسيس 20
النيتروجين السائل
الخرز الزجاجي	سيغما	جي 8893	0.5 ميكرومتر
أنبوب 2.0 مل مع غطاء لولبي			RNase مجاني
1.5 مل و 2.0 مل أنبوب إيبندورف			RNase مجاني
الطرد المركزي	إيبندورف	5430