مقايسة نمو البكتيريا المحدودة للمعادن لدراسة دور الجينات المستجيبة للمعادن

الملخص

المصدر: موراكيس، س.، وآخرون. النمو المحدود للمعادن من النيسرية البنية لتوصيف الجينات المستجيبة للمعادن والحصول على المعادن من الروابط المضيفة. J. Vis. خبرة. (2020).

يوضح هذا الفيديو مقايسة نمو البكتيريا المحدودة للمعادن لدراسة دور الجينات المستجيبة للمعادن. يتم تحضين البكتيريا من النوع البري والطافرة المزروعة في وسط مستنفد للمعادن باستخدام الترابط المعدني ، ويتم مراقبة نموها باستخدام قارئ لوحات. في ظل الظروف المستنفدة للمعادن ، تعبر البكتيريا البرية عن مستقبلات سطحية تمكن من امتصاص المعادن ونمها ، بينما يفتقر المتحور إلى هذا المستقبل ، مما يؤدي إلى تقييد النمو.

البروتوكول

1. تحضير حلول مخزون الوسائط المحددة (CDM) المعالجة ب Chelex

1. حل المخزون I
   1. اجمع بين كلوريد الصوديوم أو كلوريد الصوديوم (233.8 جم) ، وكبريتات البوتاسيوم أو K₂SO₄ (40.0 جم) ، وكلوريد الأمونيوم أو NH₄Cl (8.8 جم) ، وفوسفات الهيدروجين ثنائي البوتاسيوم أو K₂HPO₄ (13.9 جم) ، وفوسفات ثنائي هيدروجين أحادي البوتاسيوم أو KH₂PO₄ (10.9 جم) في الماء منزوع الأيونات إلى حجم نهائي قدره 1 لتر.
   2. قم بتصفية المحلول وتعقيم المحلول وتحويله إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
   3. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
2. حل المخزون II
   1. يمزج حمض الثيامين هيدروكلوريك أو حمض الهيدروكلوريك (0.2 جم) ، بيروفوسفات الثيامين Cl (0.05 جم) ، بانتوثينات الكالسيوم (0.19 جم) ، والبيوتين (0.3 جم) في 50٪ (حجم / حجم) إيثانول إلى حجم نهائي قدره 1 لتر.
   2. ضعيها في أنابيب مخروطية سعة 50 مل وخزنها عند -20 درجة مئوية.
3. حل المخزون III
   1. يجمع بين L-aspartate (4.0 جم) ، L-glutamate (10.4 جم) ، L-arginine (1.2 جم) ، الجلايسين (0.2 جم) ، L-serine (0.4 جم) ، L-leucine (0.72 جم) ، L-isoleucine (0.24 جم) ، L-valine (0.48 جم) ، L-tyrosine (0.56 جم) ، L-proline (0.4 جم) ، L-tryptophan (0.64 جم) ، L-threonine (0.4 جم) ، L-phenylalanine (0.2 جم) ، L-asparagine-H₂O (0.2 جم) ، L-glutamine (0.4 جم) ، L-histidine-HCl (0.2 جم) ، L-methionine (0.12 جم) ، L-alanine (0.8 جم) ، L-يسين (0.4 جم), وانخفاض الجلوتاثيون (0.36 ز) في 500 مل ماء منزوع الأيونات.
   2. قم بإذابة L-cysteine (0.44 جم) و L-cystine (0.28 جم) في الحد الأدنى من الحجم (~ 1 مل) من 1 M HCl وأضفه إلى محلول الأحماض الأمينية أعلاه.
   3. اضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول باستخدام 10 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) حتى تذوب جميع الجسيمات. سيكون الرقم الهيدروجيني النهائي 10.0-11.0.
   4. ارفع الحجم النهائي إلى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات.
   5. قم بتعقيم المحلول بالفلتر وتقسيمه إلى أحجام 250 مل.
   6. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
4. حل المخزون IV
   1. قم بإذابة الجلوكوز (200 جم) في ماء منزوع الأيونات إلى الحجم النهائي 1 لتر.
      ملاحظة: قد يلزم تسخين المحلول لإذابة الجلوكوز.
   2. قم بتعقيم المحلول بالترشيح وتقطيعه إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
   3. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
5. حل المخزون V
   1. يجمع بين هيبوكسانثين (5.0 جم) ويوراسيل (5.0 جم) وهيدروكسيد الصوديوم (4.0 جم) في الماء منزوع الأيونات إلى حجم نهائي يبلغ 1 لتر.
   2. قم بالتصفية والتعقيم والاقتباس في أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
   3. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
6. الحل السادس
   1. قم بإعداد محلول ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم 1 متر أو CaCl_{2-2H 2}O (147 جم / لتر) في ماء منزوع الأيونات. قم بالفلتر والتعقيم والتخزين في درجة حرارة الغرفة (RT).
7. حل المخزون السابع
   1. تحضير محلول كبريتات المغنيسيوم اللامائية 1 M (MgSO₄) في ماء منزوع الأيونات. قم بالفلتر والتعقيم والتخزين في RT.
8. حل المخزون الثامن
   1. تحضير محلول بيكربونات الصوديوم 1 M (NaHCO₃) في ماء منزوع الأيونات. قم بالفلتر والتعقيم والتخزين في RT.

2. تحضير 4x مركز معقم و 1x CDM

ملاحظة: يجب تنفيذ هذا الإجراء إما في الأواني الزجاجية المعقمة المعالجة بالحمض أو البلاستيك لمنع ترشيح المعادن في المحاليل.

1. يمزج محاليل المخزون الأول (50 مل) والثاني (20 مل) والثالث (250 مل) والرابع (50 مل) والخامس (20 مل) مع 20.0 جم من 4- (2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبرازين حمض إيثان سلفونيك (HEPES) ويحرك حتى يمتزج.
2. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 ، ثم ارفع الحجم النهائي إلى 500 مل بالماء منزوع الأيونات.
3. اغسل راتنج Chelex-100 في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات لإزالة المواد الحافظة قبل إضافته إلى المركز المعقم 4x. افعل ذلك عن طريق إضافة 50 جم من الراتنج إلى 1 لتر من الماء منزوع الأيونات والتقليب لمدة ساعة واحدة على الأقل. قم بإزالة الماء عن طريق الترشيح بالتفريغ واستخدم هذا الراتنج المغسول للخطوة 2.4.
4. أضف 50 جم من الراتنج وحركه ببطء لمدة 90 دقيقة بالضبط.
5. قم بإزالة الراتنج عن طريق تعقيم الفلتر وتخزين التركيز المعقم 4x عند 4 درجات مئوية.
6. لتحضير تركيز عمل 1x من آلية التنمية النظيفة ، قم أولا بتخفيف تركيز 4x بالماء معقم منزوع الأيونات ، ثم أضف المحلول السادس (125 ميكرولتر لكل 500 مل من محلول 1x) ، والمحلول السابع (535 ميكرولتر لكل 500 مل) ، والمحلول الثامن (10 مل لكل 500 مل).
   ملاحظة: على الرغم من أن جميع محاليل المخزون قد تم تعميرها بالفعل ، فمن المستحسن تصفية المحلول 1x مرة أخرى بعد التحضير.

3. تحضير لوحات آلية التنمية النظيفة

ملاحظة: الوصفة أدناه تصنع 1 لتر من الوسائط للأطباق ، ولكن من الأفضل تحضيرها بكميات أصغر. كل شيء يتقلص بشكل متناسب.

1. الاغاروز المغسول
   1. قم بإذابة 50 جم من الاغاروز في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات مع التحريك لمدة 1 ساعة.
   2. انقل المحلول إلى زجاجة جهاز طرد مركزي وجهاز طرد مركزي عند 1,200 × جم لمدة 15 دقيقة في RT. اسكب المادة الطافية بعناية وتخلص منها.
   3. أضف كمية كافية من الماء منزوع الأيونات لإعادة تعليق حبيبات الاغاروز ، ثم انقله إلى قارورة سعة 1 لتر. أحضر الحجم النهائي 1 لتر بالماء منزوع الأيونات ثم حركه وجهاز طرد مركزي كما في الخطوة 3.1.2. تخلص من الطواقي.
   4. أضف ما يكفي من الإيثانول بنسبة 100٪ لإعادة تعليق الحبيبات ، ثم انقله إلى قارورة جديدة سعة 1 لتر. يصل إلى الحجم النهائي 1 لتر مع الإيثانول. يقلب ويعمل بالطرد المركزي كما في الخطوة 3.1.2.
   5. كرر الخطوة 3.1.4.
   6. أضف الميثانول إلى حبيبات الاغاروز لإعادة تعليقه ، ثم انقله إلى قارورة سعة 1 لتر. أحضر الحجم النهائي 1 لتر مع الميثانول. يقلب ويعمل بالطرد المركزي كما في الخطوة 3.1.2.
   7. كرر الخطوة 3.1.6.
   8. انقلي الاغاروز المغسول إلى صينية مبطنة بورق الألمنيوم واتركيه حتى يجف في غطاء الدخان. عندما يجف ، انقله إلى وعاء خال من المعادن للتخزين طويل الأجل.
2. أضف 10 جم من الاغاروز المغسول و 5 جم من نشا البطاطس إلى 750 مل من الماء منزوع الأيونات.
3. الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة عند 121 درجة مئوية ، 100 كيلو باسكال فوق الضغط الجوي.
4. اترك الوسائط تبرد إلى ~ 65 درجة مئوية ، ثم أضف 250 مل من 4X CDM ، و 250 ميكرولتر من المحلول السادس ، و 1.07 مل من المحلول السابع ، و 20 مل من المحلول الثامن.
5. إذا رغبت في ذلك ، أضف المعادن المفضلة قبل صب الأطباق. إضافة المخلبات ليست ضرورية للحفاظ على ظروف خالية من المعادن.
6. تصب في أطباق بتري وتترك لتتجمد.

4. نمو محدود للمعادن من النيسرية البنية

ملاحظة: بالنسبة لمعظم التطبيقات ، ليس من الضروري إجهاد البكتيريا قبل تلقيح آلية التنمية النظيفة. وتكفي خطوة المضاعفة الأولية في آلية التنمية النظيفة والتخفيف اللاحق لاستنفاد المكورات البنية في مخازن الحديد والزنك الداخلية. على هذا النحو ، يتم إجراء الخطوتين الأوليين من الإجراء التالي باستخدام ألواح أجار مصنوعة من قاعدة متوسطة Gonococcus (GC) تم استكمالها بمكمل Kellogg I و 12.5 ميكرومتر نترات الحديديك (Fe (NO₃) ₃). إذا كان الإجهاد المعدني المبكر مطلوبا ، فإننا نوصي بإعداد ألواح قاعدة متوسطة GC بدون Fe (NO₃) ₃ ومع 5 ميكرومتر من الطبقة المئوية (N ، N ، N '، N'-tetrakis (2-بيريديل ميثيل) إيثيلين ديامين) لاستخلاب الزنك أو 10 ميكرومتر ديفيروكسامين لاستخلاب الحديد. يتم إجراء جميع عمليات الحضانة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.

1. قبل يومين من التجربة ، في اليوم -2 ، قم بوضع المكورات البنية من مخزون المجمد على ألواح GC المتوسطة واحتضنها لمدة لا تزيد عن 24 ساعة.
2. في اليوم -1 ، ضع مستعمرات مفردة على أطباق GC متوسطة طازجة. حاول القيام بذلك قبل 14-16 ساعة من تجربة النمو.
3. في يوم التجربة ، أضف 5-10 مل 1x CDM إلى قارورة السلاح الجانبي المحيرة المغسولة بالحمض 125 مل واستخدمها لتفريغ مقياس ألوان كليت.
4. استخدم مسحة معقمة ذات رؤوس قطنية لتلقيح آلية التنمية النظيفة من مستعمرات مفردة صحية. استهدف 20 وحدة كليت.
   ملاحظة: إذا لم يكن مقياس ألوان Klett متاحا ، فإن مقياس الطيف الضوئي مناسب أيضا. لا توجد صيغة تحويل عالمية لوحدات Klett إلى OD ، ولكن يتوفر دليل تقريبي (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
5. احتضان مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة حتى تتضاعف كتلة واحدة تقريبا (40 وحدة كليت). يجب أن يستغرق هذا ما بين 1-2 ساعة.
6. في هذه المرحلة ، يتم تخفيف الثقافات مرة أخرى عن طريق إضافة حجم كاف من آلية التنمية النظيفة للوصول إلى نصف كثافة الاستزراع الأولية (على سبيل المثال ، إذا انتقلت 5 مل من الاستزراع من 20 إلى 40 وحدة Klett ، فإن 15 مل من آلية التنمية النظيفة ستعيدها إلى 10 وحدات Klett) ، وسيستمر النمو كما في الخطوة 4.5. يعتمد المقدار المحدد للتخفيف الخلفي ، والمعالجات المعدنية ، وما إلى ذلك ، على التطبيقات النهائية. نقدم ثلاثة أمثلة أدناه

5. فحوصات النمو المحدودة للمعادن

ملاحظة: تصف هذه المقايسات خلطات النمو الجاهزة. تم وصف تحضير هذه الخلطات في القسم 6.

1. أثناء مضاعفة الكتلة في الخطوة 4.5 ، قم بمعالجة آبار صفيحة دقيقة مكونة من 96 بئرا مع 10x خلطات مسبقة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتعيين ثلاثة آبار لتكون بمثابة فراغات. إلى هذه الآبار ، أضف 10 ميكرولتر من 10x premix و 90 ميكرولتر من CDM.
2. بمجرد مضاعفة الثقافات الموجودة في قوارير السلاح الجانبي ، أضف 100 ميكرولتر من كل مزرعة إلى بئر غير مستخدم في الصفيحة الدقيقة وقم بقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600). يمكن القيام بذلك باستخدام الكوفيتات في مقياس الطيف الضوئي ، ولكن مع وجود أعداد أكبر من السلالات داخل الفحص ، يمكن أن يصبح هذا مرهقا ولا ينصح به بشكل عام ما لم يتمكن مقياس الطيف الضوئي من القياس مباشرة من ذراع قارورة الذراع الجانبية.
   1. أثناء قياس OD ، ضع القوارير مرة أخرى في الحاضنة لضمان بقاء المكورات البنية قابلة للحياة.
3. احسب المقدار الصحيح من التخفيف المطلوب لإحضار الثقافات إلى OD600 = 0.02. الخلطات المسبقة 10x لها تأثير ضئيل على OD ويمكن حذفها من الحساب.
4. قم بتخفيف الثقافات باستخدام CDM في أنابيب مزرعة صغيرة وإضافة حجم كاف لتخفيف الخلطات الجاهزة 10x إلى 1x في اللوحة. في حالة توفر جهاز تسخين الألواح ، احتفظ باللوحة عند 37 درجة مئوية أثناء العمل.
5. احتضان اللوحة لمدة 8-12 ساعة مع الاهتزاز في قارئ الألواح ، مع أخذ قياسات OD600 على فترات مطلوبة.

6. تحميل المعادن من ترانسفيرين ، S100A7 ، وكالبروتيكتين ، وإعداد 10x الخلطات الجاهزة

ملاحظة: كما هو الحال مع تحضير آلية التنمية النظيفة ، استخدم الزجاج أو البلاستيك المغسول بالحمض لتحضير المحلول.

1. قم بإذابة الترانسفيرين البشري عند 10 مجم / مل (125 ميكرومتر) في المخزن المؤقت الأولي (100 ملي تريس ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي مولار هيدروكسيد الصوديوم₃ ، الرقم الهيدروجيني = 8.4). يتم تعليق S100A7 والكالبروتكتين في مخزن مؤقت يتكون من 20 ملي مولار تريس ، و 100 ملي كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي مولار 2-ميركابتوإيثانول ، و 1 ملي مولار كلوريد الكالسيوم أو CaCl₂ ، الرقم الهيدروجيني = 8.0).
   1. أضف محلول التدوير (100 ملي سيترات الصوديوم ، 100 ملي هيدروجين_{هيدروجين 3} ، 5 ملي سداسي هيدرات كلوريد الحديد (III) أو FeCl_{3-6H 2}O ، الرقم الهيدروجيني = 8.4) إلى محلول الترانسفيرين لتحقيق 30٪ من تشبع الحديد (على سبيل المثال ، 75 ميكرولتر من محلول العرق مناسب ل 5 مل من الترانسفيرين إذا تم تصنيعه عند 10 مجم / مل).
   2. أضف كبريتات الزنك (ZnSO₄) إلى S100A7 أو كالبروتكتين بنسبة مولية 50٪ إلى البروتين لخلق تشبع بنسبة 25٪ (يحتوي كل جزيء بروتين على موقعين للربط المعدني). يمكن استخدام مستحضرات 100 ميكرومتر S100A7 أو كالبروتيكتين مع 50 ميكرومتر ZnSO₄ .
   3. في كلتا الحالتين ، اسمح بالخلط النهائي لمدة ساعة واحدة على الأقل لتحميل المعادن.
2. قم بإعداد 4 لتر من المخزن المؤقت لغسيل الكلى (40 ملي تريس ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي NaHCO₃ ، الرقم الهيدروجيني = 7.4). قسم هذا إلى حجمين منفصلين سعة 2 لتر وضع أحدهما عند 4 درجات مئوية.
3. أضف البروتينات المحملة بالمعدن إلى كاسيت غسيل الكلى باستخدام حقنة وقم بتحليل غسيل الكلى مقابل حجم المخزن المؤقت الأول لمدة 4 ساعات في RT.
4. انقل الكاسيت إلى الحجم المؤقت الثاني وقم بتحلل الكاسيت طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد هذه الخطوات ، يجب إزالة أي معادن غير مرتبطة.
   ملاحظة: ننصح بإجراء فحص حمض البيسينشونيك لتحديد تركيزات البروتين بعد غسيل الكلى.
5. استخدم 10x ترانسفيرين بريمكس لاستخدام الترانسفيرين كمصدر وحيد للحديد.
   1. قم بإعداد هذا الخلطة الجاهزة عن طريق تخفيف 30٪ من الترانسفيرين البشري وآبو ترانسفيرين البقري (المحضر عند 125 ميكرومتر كما هو موضح للترانسفيرين البشري ، دون خطوة تحميل الحديد) إلى 75 ميكرومتر و 30 ميكرومتر ، على التوالي ، في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). يستبدل الخلط المسبق للتحكم الإيجابي 30٪ من Fe-transferrin ب 75 ميكرومتر Fe (NO) ₃ ، ويحذف الخلطة المسبقة للتحكم السلبي أي حديد مضاف ، وتحتفظ فقط ب apo-transferrin البقري. في مقايسة النمو ، قم بتخفيف 10 ميكرولتر من هذه المركزات ب 90 ميكرولتر من الثقافة. التركيزات النهائية هي 7.5 ميكرومتر ، 30٪ من Fe-transferrin البشري و 3 ميكرومتر من أبو ترانسفيرين البقري.
6. استخدم نسخة معدلة من خلطة الترانسفيرين 10x للاستخدام S100A7 أو كالبروتكتين كمصدر وحيد للزنك.
   1. للحصول على خلطة مسبقة للتحكم الإيجابي ، قم بدمج 50 ميكرومتر ZnSO₄ في الخلطة الجاهزة للترانسفيرين. للتحكم السلبي ، قم بدمج 50 ميكرومتر TPEN وحذف الزنك. بعد ذلك، خذ 10 ميكرولتر من كل عينة لكل عينة مطلوبة جيدا، وانقل هذا الحجم إلى أنبوب جديد. أضف إلى هذا نصف حجم PBS المعقم. على سبيل المثال ، إذا كانت 10 آبار ستتلقى الخلطة الجاهزة للتحكم الإيجابي ، فخذ 100 ميكرولتر من الخلطة الجاهزة ، وانقلها إلى أنبوب جديد ، وأضف 50 ميكرولتر من PBS. افعل الشيء نفسه مع التحكم السلبي.
   2. لصنع S100A7 أو الخلطة الجاهزة للكالبروتيكتين ، خذ 10 ميكرولتر من الخلطة المسبقة للتحكم السلبي لكل بئر مطلوب ، وانتقل إلى أنبوب جديد ، وأضف نصف حجم 25٪ Zn-S100A7 أو كالبروتيكتين. في مقايسة النمو ، استخدم 15 ميكرولتر من الخلطة الجاهزة وقم بتخفيفها ب 85 ميكرولتر من الثقافة. تظل التركيزات النهائية للترانسفيرين كما في الخطوة 8.5 ، مع إضافة 5 ميكرومتر من الزنك أو TPEN أو S100A7 / كالبروتيكتين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
125 مل قوارير الذراع الجانبي	بيلكو	هاتف: 2578-S0030	يجب أن تكون مطلوبة حسب الطلب
2-ميركابتوإيثانول	VWR	م 131	افتح في غطاء الدخان
ورق 3 مم	جنرال إلكتريك هيلث	3030-6461	يسمى "ورق الترشيح" في النص
الاغاروز	بيولون	بيو -41025	ذرور
كلوريد الأمونيوم	سيجما ألدريتش	أ 9434	ذرور
ترانسفيرين البقري	سيجما ألدريتش	تي 1428	ذرور
كلوريد الكالسيوم ثنائي الهيدرات	سيجما ألدريتش	طراز C5080	ذرور
بانتوثينات الكالسيوم	سيجما ألدريتش	سي 8731	ذرور
كالبروتيكتين	غير متاح	غير متاح	يتم تزويدنا بهذا من قبل متعاون
راتنج Chelex-100	بيو راد	142-2832	يغسل بالماء منزوع الأيونات قبل الاستخدام
مسحة معقمة برأس قطني	البروتستانتي	25-806	القطن أفضل من البوليستر لهذا التطبيق
ديفيروكسامين	سيجما ألدريتش	D9533	ذرور
د جلوكوز	سيجما ألدريتش	جي 8270	ذرور
كاسيت غسيل الكلى	الحراريه	66380	نقع مسبقا في المخزن المؤقت قبل الاستخدام
ايثانول	كوبتيك	الإصدار 1016	سائل قابل للاشتعال ، يخزن في خزانة قابلة للاشتعال
كلوريد الحديديك	سيجما ألدريتش	F7134	مهيج ، لا تستنشق
نترات الحديديك nonahydrate	سيجما ألدريتش	إف 1143	مهيج ، لا تستنشق
قاعدة GC متوسطة	ديفكو	228950	مسحوق ، يحتوي بالفعل على أجار
الجلايسين	سيجما ألدريتش	جي 8898	ذرور
HEPES	صياد	ل -15694	ذرور
ترانسفيرين بشري	سيجما ألدريتش	تي 2030	ذرور
هيبوكسانثين	سيجما ألدريتش	[إتش9377]	ذرور
مقياس ألوان كليت	مانوستات	37012-0000	يستخدم نقل اللون لتقييم كثافة الثقافة
إل ألانين	سيجما ألدريتش	ط7627	ذرور
ارجينين	سيجما ألدريتش	أ 5006	ذرور
L-asparagine monohydrate	سيجما ألدريتش	أ 8381	ذرور
ل-أسبارتات	سيجما ألدريتش	أ 9256	ذرور
لسيستين هيدروكلوريد	سيجما ألدريتش	ج 1276	ذرور
لسيستين	سيجما ألدريتش	سي 8755	ذرور
ل-غلوتامات	سيجما ألدريتش	طراز G1251	ذرور
ل-الجلوتامين	سيجما ألدريتش	جي 3126	ذرور
إل هيستيدين أحادي هيدروكلوريد	سيجما ألدريتش	[إتش8125]	ذرور
ل-إيزولوسين	سيجما ألدريتش	ط2752	ذرور
ل-ليوسين	سيجما ألدريتش	L8000	ذرور
L-يسين	سيجما ألدريتش	L5501	ذرور
لام-ميثيونين	سيجما ألدريتش	إم 9625	ذرور
لام-فينيل ألانين	سيجما ألدريتش	ص 2126	ذرور
ل-برولين	سيجما ألدريتش	ص 0380	ذرور
إل سيرين	سيجما ألدريتش	طراز S4500	ذرور
إل ثريونين	سيجما ألدريتش	تي 8625	ذرور
ل تريبتوفان	سيجما ألدريتش	تي 0254	ذرور
لتيروزين	سيجما ألدريتش	تي 3754	ذرور
إل فالين	سيجما ألدريتش	المحرك V0500	ذرور
كبريتات المغنيسيوم	سيجما ألدريتش	م 7506	ذرور
ميثانول	VWR	BDH1135-4 ليرة لبنانية	سائل قابل للاشتعال ، يخزن في خزانة قابلة للاشتعال
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة	سيجما ألدريتش	60356	ذرور
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة	سيجما ألدريتش	ص 9791	ذرور
كبريتات البوتاسيوم	سيجما ألدريتش	ص 0772	ذرور
نشا البطاطس	سيجما ألدريتش	س4251	ذرور
انخفاض الجلوتاثيون	سيجما ألدريتش	جي 4251	تعامل بعناية. يمكن أن تتأكسد بسهولة.
طراز S100A7	غير متاح	غير متاح	يتم تزويدنا بهذا من قبل متعاون
بيكربونات الصوديوم	سيجما ألدريتش	س 5761	ذرور
كلوريد الصوديوم	VWR	470302	ذرور
سترات الصوديوم	صياد	س 279	ذرور
هيدروكسيد الصوديوم	أكروس أورجانيكس	383040010	استرطابي للغاية
هيدروكلوريد الثيامين	سيجما ألدريتش	تي 4625	ذرور
بيروفوسفات الثيامين	سيجما ألدريتش	طراز 8754	وتسمى أيضا الكوكربوكسيلاز
تي بي إين	سيجما ألدريتش	ص 4413	ذرور
تريس	VWR	497	ذرور
يوراسيل	سيجما ألدريتش	الرقم U0750	ذرور
كبريتات الزنك سباعي الهيدرات	سيجما ألدريتش	204986	مهيج ، لا تستنشق