الكشف عن ناقلات المعادن السطحية في النيسرية البنية باستخدام لطخة نقطية

الملخص

المصدر: Maurakis، S.، and Cornelissen، C.N. النمو المحدود للمعادن من Neisseria gonorrhoeae لتوصيف الجينات المستجيبة للمعادن والحصول على المعادن من الروابط المضيفة. J. Vis. خبرة. (2020)

يوضح هذا الفيديو إجراء الكشف عن ناقلات المعادن السطحية في النيسرية البنية المزروعة في ظل ظروف محدودة المعدن باستخدام مقايسة لطخة نقطية ، بما في ذلك ربط الترابط ، واكتشاف الأجسام المضادة ، والتصور اللوني.

البروتوكول

1. الكشف عن ربط الترابط بواسطة ناقلات المعادن الغشائية الخارجية

1. عودة تمييع الثقافات بثلاثة أحجام من CDM (الوسط المحدد المعالج بالمخلوقات).
2. ثم احتضان مع الاهتزاز لمدة 4 ساعات.
3. قبل فترة وجيزة من علامة 4 ساعات ، قم بقص ثلاث قطع من ورق الترشيح وقطعة من النيتروسليلوز إلى الحجم التقريبي المطلوب لتناسب جهاز لطخة نقطية. انقع النيتروسليلوز مسبقا في ماء منزوع الأيونات ، ثم قم بتجميع الجهاز بورق ترشيح أسفل النيتروسليلوز.
4. في 4 ساعات ، سجل كثافة الخلايا وقم بتوحيد الكثافة النهائية المناسبة.
5. تزرع خلايا الماصة على النيتروسليلوز وتتيح وقتا كافيا لورق الترشيح لامتصاص كل السائل.
6. قم بتفكيك الجهاز ، واترك اللطخة تجف ، وسد غشاء النيتروسليلوز لمدة ساعة واحدة في ألبومين مصل البقر بنسبة 5٪ أو حليب خالي الدسم (وزن / حجم) في محلول ملحي مخزن.
7. أعد تجميع جهاز اللطخة النقطية ، واستبدل ورق الترشيح بغشاء البارافين لإنشاء ختم مانع للتسرب تحت النيتروسليلوز.
8. قم بتخفيف الترابط المرتبط بالمعدن ذي الأهمية إلى 0.2 ميكرومتر في خلايا الحاصرات والمسبار لمدة ساعة واحدة.
9. اسحب السائل بفراغ ، واغسل اللطخة ، ثم اتبع الإجراءات المناعية القياسية لتطوير الإشارة. يمكن إجراء خطوات الغسيل داخل الجهاز أو خارجه.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
125 مل قوارير الذراع الجانبي	بيلكو	هاتف: 2578-S0030	يجب أن تكون مطلوبة حسب الطلب
2-ميركابتوإيثانول	VWR	م 131	افتح في غطاء الدخان
ورق 3 مم	جنرال إلكتريك هيلث	3030-6461	يسمى "ورق الترشيح" في النص
مانع درجة النشاف	بيو راد	170-6404	الحليب الجاف الخالي من الدسم
ألبومين مصل الأبقار	روش	3116964001	ذرور
كالبروتيكتين	غير متاح	غير متاح	يتم تزويدنا بهذا من قبل متعاون
راتنج Chelex-100	بيو راد	142-2832	يغسل بالماء منزوع الأيونات قبل الاستخدام
مسحة معقمة برأس قطني	البروتستانتي	25-806	القطن أفضل من البوليستر لهذا التطبيق
جهاز لطخة نقطية	شلايشر آند شويل	10484138	أغلق الغطاء بإحكام قدر الإمكان قبل تحميل العينة
ايثانول	كوبتيك	الإصدار 1016	سائل قابل للاشتعال ، يخزن في خزانة قابلة للاشتعال
مقياس ألوان كليت	مانوستات	37012-0000	يستخدم نقل اللون لتقييم كثافة الثقافة
ميثانول	VWR	BDH1135-4 ليرة لبنانية	سائل قابل للاشتعال ، يخزن في خزانة قابلة للاشتعال
النيتروسليلوز	جنرال إلكتريك هيلث	10600002	يحفظ في غلاف واقي حتى الاستخدام
طراز S100A7	غير متاح	غير متاح	يتم تزويدنا بهذا من قبل متعاون
كلوريد الصوديوم	VWR	470302	ذرور
تريس	VWR	497	ذرور