قياس معدلات الترجمة الخاطئة للمتفطرة باستخدام نظام GFP / Luciferase Reporter

الملخص

المصدر: Chen، Y.، et al.، قياس معدلات الترجمة الخاطئة للبكتيريا الفطرية المحددة باستخدام أنظمة المراسل لكسب الوظيفة. J. Vis. خبرة. (2019)

يوضح هذا الفيديو طريقة لقياس الترجمة الخاطئة في المتفطرة smegmatis باستخدام نظام GFP المحثي ونظام مراسل لوسيفيراز المتحور المفرز. يوضح كيف يتم قياس التلألؤ الناتج عن الترجمة الخاطئة ومقارنته بمضان GFP لتقييم تأثير جزيء الاختبار على الدقة الانتقالية.

البروتوكول

1. مراسل Nanoluc luciferase (Nluc) / بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP)

ملاحظه: للحصول على تمثيل مرئي لهذه الطريقة ، انظر الشكل 1.

1. قم بتلقيح سلالة المراسل البكتيري من مخزون -80 درجة مئوية ب 2 مل من وسط 7H9. رج العبوة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 إلى 2 أيام حتى يصل OD₆₀₀ إلى المرحلة الثابتة (OD >3).
2. الاستزراع الفرعي إلى 50 مل من 7H9 متوسط وينمو حتى يصل OD₆₀₀ إلى المرحلة الثابتة المتأخرة (>4).
3. قبل نقل البكتيريا إلى صفيحة 96 بئرا ، أضف أنهيدروتتراسيكلين (ATC) بتركيز نهائي يبلغ 50 نانوغرام / مل واخلطه جيدا. يضمن تحريض الاستزراع السائب أن تحتوي جميع الآبار على نفس الكمية من المحفز وأن تحريض المراسل متزامن. قم بتحويل البكتيريا إلى صفيحة شفافة ذات قاع مستدير من 96 بئرا ، مع حجم 100 ميكرولتر في كل بئر.
4. للكشف عن الجزيئات الصغيرة التي تؤثر على معدلات الترجمة الخاطئة ، أضف المركب بالتركيز المشار إليه لاختيار الآبار. لأغراض هذا البروتوكول, استخدام kasugamycin (بالجرعات المشار إليها في الشكل 2) كتوضيح. أضف جرعات مختلفة من kasugamycin لاختيار الآبار (يجب أن تحتوي كل مجموعة تجريبية على اثنين على الأقل من التكرارات البيولوجية).
5. رج العينات وحثها على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 16-20 ساعة.
   ملاحظه: من الضروري ختم اللوحة بالفيلم. أيضا ، يجب ملء جميع الآبار الطرفية بما لا يقل عن 200 ميكرولتر من الماء المعقم للحد من التبخر من آبار الاختبار.
6. خذ 80 ميكرولتر من كل بئر ، باستخدام ماصة متعددة القنوات ، وانقل العينات إلى لوحة سوداء ذات 96 بئرا (مما يزيد من قياس إشارة التألق). قم بقياس إشارة GFP بواسطة مقياس الإضاءة ب 20 مللي ثانية كوقت تكامل.
7. بعد قياس إشارة GFP ، قم بطرد مركزي اللوحة عند 3,220 × جم لمدة 10 دقائق. انقل 50 ميكرولتر من المادة الطافية إلى صفيحة ذات 96 بئرا ذات قاع أبيض (مما يزيد من قياس إشارة التلألؤ) ، وأضف 50 ميكرولتر من ركيزة Nluc إلى كل بئر ، واخلطها جيدا ، وقم بقياس التلألؤ بواسطة مقياس الإضاءة مع 1,000 مللي ثانية كوقت تكامل.
8. حدد نسبة Nluc / GFP بقسمة قيم تلألؤ Nluc المصححة على مضان GFP: هذا المقياس (بالوحدات التعسفية) هو مقياس نسبي للأسبارتات لترجمة الأسبارجين.

النتائج

الشكل 1: مخطط لقياس معدل الترجمة الخاطئة مراسل Nluc-GFP. تزرع ثقافة جديدة من M. smegmatis ، التي تم تحويلها مع مراسلي Nluc و GFP ، إلى حجم كاف لجميع الألواح المراد اختبارها (بافتراض ~ 10 مل / 96 بئر لوحة). مباشرة قبل سحب المزرعة البكتيري...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ميدلبروك 7H9	بي دي ديفكو	271310
أنهيدروتتراسيكلين	كايمان كيميكال	10009542
كاسوغامايسين	سيغما	ك 4013
مقايسة Nano-Glo luciferase	بروميجا	رقم 1120
مقياس إضاءة Fluoroskan Ascent FL	الحراريه	/
لوحة الفحص ، 96 بئر أبيض ، مسطح القاع عالية الربط ، بدون غطاء	كوستار	3922
لوحة الفحص ، 96 بئر أسود ، أسفل مسطح ارتفاع ، بدون غطاء	كوستار	3925
96 مجموعة زراعة خلية البئر ، قاع مسطح مع غطاء	كوستار	3599
الأشعة فوق البنفسجية-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N	NA	NA	البلازميد المكوكي العرضي مع نسخة إسرية محفزة للتتراسيكلين من Nluc luciferase المتحور
pMC1S-GFP	NA	NA	ناقل المتفطرات المتكاملة (موقع L5) للتعبير المحفز للتتراسيكلين من GFP