تزامن ثقافة البكتيريا الزرقاء وضغط الحمض النووي مدفوع بدورات الضوء والظلام

الملخص

المصدر: موراتا ، ك. وآخرون ، تصور ضغط الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء بواسطة التصوير المقطعي بالإلكترون بالتبريد عالي الجهد. J. Vis. خبرة. (2018)

يوضح هذا الفيديو الزراعة المتزامنة للبكتيريا الزرقاء في ظل دورات الضوء والظلام لدراسة ضغط الحمض النووي الذي ينظمه الساعة البيولوجية. يكشف الفحص المجهري الفلوري عن الحمض النووي المكثف في نقاط زمنية محددة ، مما يؤكد محاذاة دورة الخلية عبر السكان.

البروتوكول

1. الثقافة المتزامنة للبكتيريا الزرقاء

1. ثقافة Synechococcus elongatus PCC 7942 على صفيحة متوسطة معقمة من اللون الأزرق والأخضر 11 (BG 11) (في طبق بتري بلاستيكي معقم مقاس 9 سم) يحتوي على 1.5٪ (وزن / حجم) أجار و 0.3٪ (وزن / حجم) ثيوسلفات الصوديوم.
2. ضع الألواح في غرفة نمو عند 23 درجة مئوية بشدة ضوء تبلغ 50 ميكرو إ / م² / ثانية وعرضها لدورات مظلمة لمدة 12 ساعة / 12 ساعة.
3. انقل الخلايا إلى ألواح أجار BG11 جديدة مرة واحدة في الأسبوع.
   ملاحظه: ستظهر الثقافات الموجودة على الأجار كشرائط خضراء للخلايا المتكاثرة بنشاط بعد أسبوع واحد في ظل ظروف الثقافة هذه.
4. خذ كتلا خضراء من الخلايا ذات حلقة سلكية معقمة باللهب وقم بربط الخلايا على صفيحة أجار BG11 جديدة. افعل ذلك على مقعد نظيف.

2. المراقبة بالفحص المجهري الفلوري

1. استخدم الخلايا المزروعة على لوحة الأجار لمدة 6 أيام لمراقبة ضغط الحمض النووي. اجمع الخلايا من الصفيحة في نهاية فترة الضوء عن طريق صب 1 مل من محلول السكروز 0.2 M على الخلايا. كرر صب المحلول على الخلايا حتى يتم جمع معظم الخلايا. انقل محلول الخلية العالقة إلى أنبوب دقيق لتلطيخ الحمض النووي.
2. أضف صبغة تلطيخ الحمض النووي (على سبيل المثال ، Hoechst 33342) إلى 500 ميكرولتر من محلول الخلية العالقة في أنبوب دقيق إلى تركيز نهائي يبلغ 1 ميكروغرام / مل. ثم احتفظ بالأنبوب في الظلام لمدة 10 دقائق.
3. جهاز طرد مركزي لمدة 1 دقيقة عند 2,000 × جم لترسيب الخلايا. تخلص من المادة الطافية وأضف 10 ميكرولتر من محلول السكروز 0.2 M للحصول على تعليق خلوي كثيف.
4. انقل 1 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على خلايا ملطخة إلى زجاج منزلق ، ضع زلة غطاء ، وراقب باستخدام مجهر مضان مزود بفلتر فوق بنفسجي (UV) باستخدام عدسة موضوعية بتكبير 100X وزيت الغمر.
5. تأكد من ملاحظة انضغاط الحمض النووي في هذه المرحلة في معظم الخلايا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حل Hoechst 33342	دوجيندو	346-07951	1 ملغ / مل في الماء
مسحوق أجار (لزراعة النبات)	واكو	016-11875
حمض البوريك	واكو	027-02192
كلوريد المنغنيز رباعي الهيدرات	واكو	139-00722
كبريتات الزنك سباعي الهيدرات	واكو	264-00405
موليبدات الصوديوم	واكو	196-02472
كبريتات النحاس خماسي الهيدرات	واكو	039-04412
نترات الكوبالت سداسي هيدرات	واكو	031-03752
نترات الصوديوم	واكو	191-02542
كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات	واكو	131-00405
كلوريد الكالسيوم يجف	واكو	031-00435
حامض الستريك	واكو	036-05522
EDTA-2Na	دوجيندو	343-01861
صودا	واكو	197-01581
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة	واكو	164-04295
TES (المخزن المؤقت للجيد)	دوجيندو	344-02653
سترات الأمونيوم الحديديك	واكو	092-00802
ثيوسلفات الصوديوم خماسي الهيدرات	واكو	197-03585
مجهر الفلورسنت	نيكون	كسوف 50i