تخليق مستضدات بروتين الغشاء المستقرة بالقرص النانوي باستخدام نظام خال من الخلايا

الملخص

المصدر: جيلمور ، إس إف ، وآخرون. إنتاج مدرج خال من الخلايا وإضافة مساعدة إلى بروتين الغشاء الخارجي الرئيسي المؤتلف من الكلاميديا موريداروم لتطوير اللقاح. J. Vis. خبرة. (2022)

يوضح هذا الفيديو التخليق الخالي من الخلايا لمستضدات البروتين الغشائي المستقرة بالقرص النانوي باستخدام نظام مزدوج الحجرة. يحافظ الجهاز على الظروف المثلى لتخليق البروتين الفعال والطي المناسب والتكامل المستقر في الأقراص النانوية.

البروتوكول

الإنتاج الخالي من الخلايا لجزيئات البروتين النانوي للغشاء الخارجي الرئيسي (MOMP-tNLPs) لتركيبات لقاح الوحدات الفرعية

1. قم بإعداد MOMP-tNLPs باستخدام طرق خالية من الخلايا.
   1. قبل ساعتين من إعداد التفاعل الخالي من الخلايا ، افتح مجموعة تعبير البروتين الخالي من الخلايا بدائية النواة وقم بإذابة أحد المخازن المؤقتة لإعادة التكوين. بمجرد إذابة الجليد ، أضف قرصا واحدا من كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من حمض الإيثيلين أمين رباعي أسيتيك (EDTA) واتركه يذوب تماما.

2. اتبع هذا البروتوكول باستخدام مجموعة مصممة لتشغيل تفاعلات 5 × 1 مل.

   ملاحظه: الإنتاج النموذجي للتوسع هو 3 × 1 مل.

   1. لكل تفاعل سعة 1 مل ، أضف 525 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التكوين إلى زجاجة بكتريا قولونية محللة ولفه برفق حتى يذوب. أضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التكوين إلى الزجاجة التي تحتوي على إضافات تفاعلية (على سبيل المثال ، أدينوسين ثلاثي الفوسفات ، جوانوزين ثلاثي الفوسفات) ولفه برفق حتى يذوب.
   2. أضف 8.1 مل من المخزن المؤقت لإعادة التكوين إلى زجاجة تغذية التفاعل ، وقم بتغليفها بسدادة مطاطية (احرص على عدم لمس الجزء الداخلي من السدادة المطاطية) ، واقلبها / لفها برفق لتذوب.
   3. أضف 3 مل من المخزن المؤقت لإعادة التكوين إلى زجاجة خليط الأحماض الأمينية ، ثم قم بتغليفها بسدادة مطاطية ، ثم اقلبها / لفها برفق لتذوب.
      ملاحظه: احرص على عدم لمس الجزء الداخلي من السدادة المطاطية لأن ذلك قد يؤدي إلى التلوث.
   4. أضف 1.8 مل من المخزن المؤقت لإعادة التكوين إلى زجاجة الميثيونين ، ولفها برفق حتى تذوب ، ثم احفظها على الثلج حتى الاستخدام.
       
3. تحضير محلول التفاعل.
   1. إلى زجاجة بكتريا قولونية محللة ، أضف 225 ميكرولتر من مزيج التفاعل المعاد تكوينه ، و 270 ميكرولتر من مزيج الأحماض الأمينية المعاد تكوينه بدون ميثيونين ، و 30 ميكرولتر من الميثيونين المعاد تكوينه. بالإضافة إلى ذلك ، أضف 400 ميكرولتر من خليط 1،2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) / telodendrimer ، و 15 ميكروغرام من بلازميد MOMP ، و 0.6 ميكروغرام من بلازميد Δ49ApolipoproteinA1. لف / رج برفق للمزج.
      ملاحظه: تأكد من أن كلا البلازميدتين مبنيان من نفس العمود الفقري للبلازميد. لا تقم بالدوامة.
   2. خذ 20 ميكرولتر من المحلول الكلي وضعه جانبا في أنبوب 1.5 مل لتفاعل التحكم عبر البروتين الفلوري الأخضر (GFP) (انظر أدناه).
       
4. تحضير محلول العلف. أضف إلى زجاجة مزيج العلف 2.65 مل من مزيج الأحماض الأمينية المعاد تكوينه بدون ميثيونين و 300 ميكرولتر من الميثيونين المعاد تكوينه. لف/رج برفق حتى يذوب.
   ملاحظه: في هذا الوقت ، يمكن إعادة المخزن المؤقت غير المستخدم لإعادة التكوين والميثيونين إلى الفريزر للتخزين.
    
5. انقل 1 مل من محلول التفاعل إلى غرفة التفاعل الداخلية المتوفرة في مجموعة التفاعل الخالية من الخلايا وأغلقها عند ملئها. انقل 10 مل من محلول التغذية إلى الغرفة الخارجية لوعاء التفاعل والختم.
   ملاحظه: لا تملأ الغرف أكثر من اللازم! سيؤثر وجود فقاعات الهواء في الجزء العلوي من كل من غرفة التفاعل الداخلية وغرفة التغذية الداخلية سلبا على التفاعل. يمكن وضع أي محلول تفاعل متبقي في أنبوب سعة 1.5 مل والسماح له بالاختلاط بجانب الوعاء الرئيسي.
    
6. أضف 0.5 ميكرولتر من بلازميد التحكم GFP (0.5 مجم / مل) إلى خليط التفاعل 20 ميكرولتر الذي تم تحديده سابقا.
   ملاحظه: يتم تزويد العديد من المجموعات ببلازميد تحكم لأغراض مراقبة الجودة. يمكن أيضا استخدام معظم GFP الذي يعبر عن البلازميد مع محفز T7 وموقع ربط الإشريكية القولونية الريبوسوم (RBS) كبلازميد تحكم.
    
7. ضع التفاعل في شاكر عند 300 دورة في الدقيقة ، 30 درجة مئوية لمدة تصل إلى 18 ساعة. للتحقق من نجاح التفاعل ، استخدم مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية للتحقق من التألق بسبب تخليق GFP للتحكم (الشكل 1) بعد أقل من 15 دقيقة من الحضانة.
   ملاحظه: قد تحتاج هذه الظروف ، وخاصة درجة الحرارة ، إلى التحسين للتعبير عن بروتينات الغشاء الأخرى.

النتائج

الشكل 1: التعبير عن MOMP-tNLP وتنقيته. (أ) صورة لأنابيب تحتوي على أضواء صغيرة من تفاعل خال من الخلايا عبرت بنجاح عن ضوابط GFP في الإضاءة تحت مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية (يمين) مقارنة بالمحللات بدون بلازميد GFP (يسا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1،2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) كمسحوق	أفانتي لليبيدات القطبية	850345
1.5 مل أنابيب طرد مركزي خالية من السموم الداخلية	إيبندورف	2600028
شاكر الحاضنة C24	نيو برونزويك العلمية
نظام التعبير الخالي من الخلايا: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit	التكنولوجيا الحيوية الأرنب	BR1400201
cOmplete، كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTA	روش للتشخيص الجزيئي	4693132001
شاكر المداري
PEG5K-CA8 Telodendrimer (منتج توليف مخصص)
ناقل pIVEX2.4d	روش للتشخيص الجزيئي
طقم البلازميد ماكسي	كياجين	12162
مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية