وصمة عار غربية لتقييم السلامة الهيكلية لمستضد اللقاح البكتيري

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: جيلمور ، إس إف وآخرون. إنتاج مدرج خال من الخلايا وإضافة مساعدة إلى بروتين الغشاء الخارجي الرئيسي المؤتلف من الكلاميديا موريداروم لتطوير اللقاح. J. Vis. خبرة. (2022)

يوضح هذا الفيديو استخدام النشاف الغربي لتقييم السلامة الهيكلية لبروتين الغشاء الخارجي الرئيسي (MOMP) داخل مجمعات اللقاحات القائمة على الجسيمات النانوية. يحدد الخطوات الرئيسية المتضمنة في نقل البروتين ، ووضع العلامات على الأجسام المضادة ، والتصوير الفلوري.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. وصمة عار غربية

بالنسبة للنشاف الغربي ، قم بحل بروتين الغشاء الخارجي الرئيسي (MOMP) - جزيئات البروتين النانوي telodendrimer (tNLPs) بواسطة SDS-PAGE وانقل المواد الهلامية باستخدام نظام نشاف جاف تجاري مع إعدادات قياسية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
1. قم بإزالة البقع من المكدس بعد اكتمال النقل ، واحتضن كل لطخة طوال الليل عند 4 درجات مئوية في مخزن مؤقت مناسب يحتوي على 0.2٪ Tween 20 وإما 0.5 مجم / مل من الأجسام المضادة أحادية النسيلة (MAb) 40 أو 0.2 مجم / مل MAbHIS الأجسام المضادة للعلامة His-tag الموجهة ضد His-tag من بروتين Δ49ApoA1.
  ملاحظه: تخفيفات الأجسام المضادة المستخدمة في النشاف هي 1: 1,000 ل MAb40 و 1: 500-1,000 للأجسام المضادة MAbHIS.
2. اغسل كل لطخة 3 مرات لمدة 5 دقائق باستخدام PBS-T (1x محلول ملحي مخزن فوسفات (PBS) ، 0.2٪ توين 20 ، درجة الحموضة 7.4).
3. احتضان البقع لمدة ساعة واحدة في المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على جسم مضاد ثانوي مقترن بالفلوروفور (على سبيل المثال ، صبغة الأشعة تحت الحمراء (IRDye)) عند تخفيف 1: 10,000.
4. أعد غسل البقع 3 مرات لمدة 5 دقائق باستخدام PBS-T. استخدم جهاز تصوير مضان لتصوير البقع بعد الغسيل النهائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي
iBlot + 2:22 نظام النفخ الجاف	تقنيات الحياة
مكدسات نقل iBlot 2 ، PVDF	تقنيات الحياة	IB24001
برنامج Image Studio V2.0	لي-كور بيوسينسز
غشاء PVDF لطخة المناعة	بيو راد	1620177
جهاز تصوير LI-COR Odyssey Fc	لي-كور بيوسينسز
Odyssey Blocking Buffer في TBS يحتوي على 0.2٪ Tween 20	لي-كور بيوساينس	927-50000
شاكر المداري
PBS-T (1x PBS ، 0.2٪ Tween 20 ، درجة الحموضة 7.4)
الجسم المضاد الأساسي: MAb40 (جسم مضاد أحادي النسيلة للمجال المتغير 1 (VD1) من C. muridarum MOMP
الجسم المضاد الأساسي: MAbHIS، Penta-His الجسم المضاد	كياجين	34660
الأجسام المضادة الثانوية: IRDye 800CW ماعز (متعدد النسيل) مضاد للفأر IgG (ثقيل وخفيف)	لي-كور بيوساينس	926-32210

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن