تحضير وتحويل البكتيريا باستخدام التثقيب الكهربائي عالي الجهد

Abstract

المصدر: ستيفان ، أ. ، وآخرون ، الفوائد متعددة الأوجه للتعبير المشترك عن البروتين في الإشريكية القولونية. J. Vis. خبرة. (2015)

يوضح هذا الفيديو إجراء تحويل الإشريكية القولونية باستخدام بلازميد يحمل جين مقاومة للمضادات الحيوية ، بما في ذلك تحضير الخلايا ، والتثقيب الكهربائي ، والتعافي ، واختيار المحولات.

Protocol

1. عزل المحولات المشتركة الإشريكية القولونية

1. قم بإعداد الخلايا المختصة بالكهرباء من سلالة الإشريكية القولونية المناسبة لتحويلها. انقله إلى 1 مل من وسط Luria-Bertani (LB) (التربتون ، مستخلص الخميرة ، كلوريد الصوديوم عند 10 و 5 و 10 جم / لتر ، على التوالي) مستعمرة واحدة من السلالة المختارة ، واحتضان عند 37 درجة مئوية تحت ظروف اهتزاز 180 دورة في الدقيقة. قم بتخفيف الاستزراع المسبق 1:500 في 25 مل من وسط LB الطازج واحتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية.
2. في المرحلة اللوغاريتمية (0.6 OD أو الكثافة البصرية) ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 5,000 × جم لمدة 20 دقيقة ، وأعد تعليق الحبيبات في 10٪ ، v / v ماء الجلسرين المعقم المثلج البارد في نصف حجم المزرعة الأصلية. كرر هذه الخطوة 4 مرات ، مع خفض حجم إعادة التعليق إلى النصف. أخيرا ، أعد تعليق الحبيبات في الجلسرين / الماء وقسم معلق الخلية إلى 50 ميكرولتر من الحصات. قم بتخزين الكميات في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى 6 أشهر.
3. قم بإذابة البلازميد المطلوب في ماء معقم مكمل ب 0.5 ملي مولار EDTA (حمض الإيثيلين أمينيترا أسيتيك). قم بإذابة جزء من الخلايا المختصة بالكهرباء على الجليد واخلطه بكمية مناسبة (2.5-5 نانوغرام) من المتجه. ضعي الخليط في كوفيت 0.1 سم مناسب للتثقيب الكهربائي وضعي 1.8 كيلو فولت.
4. انقل الخلايا الكهربائية على الفور إلى 1 مل من SOC (مرق سوبر الأمثل مع قمع الكاتابوليت) وسط (وسط LB مكمل ب 0.2٪ وزن / حجم جلوكوز ، 10 ملي MgCl₂ ، 2.5 ملي KCl) ، احتضان لمدة ساعة واحدة تحت الاهتزاز ، وأخيرا نقل 100 ميكرولتر إلى أطباق بتري تحتوي على أجار LB مع المضاد الحيوي المناسب. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
5. قم بتنقية المحولات عن طريق وضع مستعمرات مفردة على أطباق بتر.

Materials