تحضير وتحويل البكتيريا باستخدام التثقيب الكهربائي عالي الجهد

الملخص

المصدر: ستيفان ، أ. ، وآخرون ، الفوائد متعددة الأوجه للتعبير المشترك عن البروتين في الإشريكية القولونية. J. Vis. خبرة. (2015)

يوضح هذا الفيديو إجراء تحويل الإشريكية القولونية باستخدام بلازميد يحمل جين مقاومة للمضادات الحيوية ، بما في ذلك تحضير الخلايا ، والتثقيب الكهربائي ، والتعافي ، واختيار المحولات.

البروتوكول

1. عزل المحولات المشتركة الإشريكية القولونية

1. قم بإعداد الخلايا المختصة بالكهرباء من سلالة الإشريكية القولونية المناسبة لتحويلها. انقله إلى 1 مل من وسط Luria-Bertani (LB) (التربتون ، مستخلص الخميرة ، كلوريد الصوديوم عند 10 و 5 و 10 جم / لتر ، على التوالي) مستعمرة واحدة من السلالة المختارة ، واحتضان عند 37 درجة مئوية تحت ظروف اهتزاز 180 دورة في الدقيقة. قم بتخفيف الاستزراع المسبق 1:500 في 25 مل من وسط LB الطازج واحتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية.
2. في المرحلة اللوغاريتمية (0.6 OD أو الكثافة البصرية) ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 5,000 × جم لمدة 20 دقيقة ، وأعد تعليق الحبيبات في 10٪ ، v / v ماء الجلسرين المعقم المثلج البارد في نصف حجم المزرعة الأصلية. كرر هذه الخطوة 4 مرات ، مع خفض حجم إعادة التعليق إلى النصف. أخيرا ، أعد تعليق الحبيبات في الجلسرين / الماء وقسم معلق الخلية إلى 50 ميكرولتر من الحصات. قم بتخزين الكميات في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى 6 أشهر.
3. قم بإذابة البلازميد المطلوب في ماء معقم مكمل ب 0.5 ملي مولار EDTA (حمض الإيثيلين أمينيترا أسيتيك). قم بإذابة جزء من الخلايا المختصة بالكهرباء على الجليد واخلطه بكمية مناسبة (2.5-5 نانوغرام) من المتجه. ضعي الخليط في كوفيت 0.1 سم مناسب للتثقيب الكهربائي وضعي 1.8 كيلو فولت.
4. انقل الخلايا الكهربائية على الفور إلى 1 مل من SOC (مرق سوبر الأمثل مع قمع الكاتابوليت) وسط (وسط LB مكمل ب 0.2٪ وزن / حجم جلوكوز ، 10 ملي MgCl₂ ، 2.5 ملي KCl) ، احتضان لمدة ساعة واحدة تحت الاهتزاز ، وأخيرا نقل 100 ميكرولتر إلى أطباق بتري تحتوي على أجار LB مع المضاد الحيوي المناسب. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
5. قم بتنقية المحولات عن طريق وضع مستعمرات مفردة على أطباق بتر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
اجار	سيجما ألدريتش	أ 1296
الأمبيسيلين	سيجما ألدريتش	أ 9518
إيدتا	سيجما ألدريتش	إد إس
الجلسرين	سيجما ألدريتش	جي 5516
KCl	سيجما ألدريتش	ص 9541
MgCl₂	سيجما ألدريتش	م 2670
كلوريد الصوديوم	سيجما ألدريتش	31434
التربتون	سيجما ألدريتش	95039
مستخلص الخميرة	فلوكا	70161
كوفيت 0.1 سم	بيوراد	1652089	للتثقيب الكهربائي
جهاز طرد مركزي 5415R	إيبندورف
جهاز طرد مركزي أليجرا 21R	بيكمان
الجين النبض الثاني التثقيب الكهربائي	بيوراد