$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. عزل الإشريكية القولونية أو الإشريكية القولونية المحولات المشتركة
- قم بإعداد الخلايا المختصة بالكهرباء من سلالة الإشريكية القولونية المناسبة لتحويلها. انقله إلى 1 مل من وسط Luria-Bertani (LB) (التربتون ، مستخلص الخميرة ، كلوريد الصوديوم أو كلوريد الصوديوم عند 10 و 5 و 10 جم / لتر ، على التوالي) مستعمرة واحدة من السلالة المختارة ، واحتضان عند 37 درجة مئوية تحت ظروف اهتزاز 180 دورة في الدقيقة. قم بتخفيف الاستزراع المسبق 1:500 في 25 مل من وسط LB الطازج واحتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية.
- في المرحلة اللوغاريتمية (0.6 OD) ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 5,000 × جم لمدة 20 دقيقة ، وأعد تعليق الحبيبات في 10٪ ، v / v ماء الجلسرين المعقم المثلج في نصف حجم الثقافة الأصلي. كرر هذه الخطوة 4 مرات ، مع خفض حجم إعادة التعليق إلى النصف في كل مرة. أخيرا ، أعد تعليق الحبيبات في الجلسرين / الماء وقسم معلق الخلية إلى 50 ميكرولتر من الحصات. قم بتخزين الكميات في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى 6 أشهر.
- قم بإذابة البلازميد المطلوب في ماء معقم مكمل ب 0.5 ملي مولار حمض إيثيلين أمينرتيتراأسيتيك (EDTA). قم بإذابة الثلج على الجليد من الخلايا المختصة بالكهرباء واخلطها بكمية مناسبة (2.5-5 نانوغرام) من المتجه. ضعي الخليط في كوفيت 0.1 سم مناسب للتثقيب الكهربائي ، وضعي 1.8 كيلو فولت.
- انقل الخلايا الكهربائية على الفور إلى 1 مل من المرق الأمثل الفائق مع وسط قمع الكاتابوليت (SOC) (وسط LB مكمل ب 0.2٪ وزن / حجم جلوكوز ، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم أو MgCl2 ، 2.5 ملي كلوريد البوتاسيوم أو KCl) ، احتضان لمدة ساعة واحدة تحت الرج ، وأخيرا نقل 100 ميكرولتر إلى أطباق بتري تحتوي على LB agar مع المضاد الحيوي المناسب. احتضان طوال الليل (O / N) عند 37 درجة مئوية.
- قم بتنقية المحولات عن طريق وضع مستعمرات مفردة على أطباق بتر.
- قم بإعداد الخلايا المختصة بالكهرباء من المحولات الأولية وكرر الخطوات من 1.1 إلى 1.5 للتحويل باستخدام المزيد من البلازميدات.
- تحضير مخزون الجلسرين من المحولات المشتركة. نقل مستعمرة واحدة في LB مكمل بالمضادات الحيوية المناسبة ، واحتضان عند 37 درجة مئوية تحت الاهتزاز ، وفي المرحلة اللوغاريتمية (0.6 OD) ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 5,000 × جم لمدة 20 دقيقة. أعد تعليق الحبيبات في وسط مضادات حيوية LB يحتوي على 15٪ جلسرين حجم. يوزع في الحصص ويخزن في درجة حرارة - 80 درجة مئوية.
2. تحليل الطفرات للمجموعات السكانية التي تعبر عن الوحدة الفرعية ε من النوع البري للإشريكية القولونية بوليميراز الحمض النووي III ومتغير εD12A الطافر
- نقل مستعمرة واحدة من الإشريكية القولونية TOP10 تحتوي على ناقلات pBAD-ε و pGOOD1-εD12A إلى 1 مل من وسط المضادات الحيوية LB. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
- قم بتخفيف الاستزراع المسبق 1:250 في 3 قوارير تحتوي على وسط طازج (10 مل) ، أضف المحرضات المناسبة (أرابينوز ، الأيزوبروبيل β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ، أو أرابينوز و IPTG ، 1 ملي مولار لكل منهما) ، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 8 ساعات. استعد في ثقافات غير مستحثة موازية.
- اجمع كميات 1 مل ، ثم قم بتخفيف 1:500 في قوارير جديدة تحتوي على وسط طازج (10 مل) مكمل أو لا مع المحرضات المناسبة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
- كرر الخطوتين 2.2 و 2.3 واجمع حصص 1 مل.
- حدد عدد الأجيال التي حدثت في كل ثقافة. نقل على ألواح LB ، 100 ميكرولتر من التخفيفات التسلسلية المناسبة للتلقيح والثقافة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية. عد المستعمرات على لوحات LB ، واحسب سجل عدد الخلايا الموجودة في اللقاح (السجلالأول) وفي المزرعة في نهاية النمو (السجلC). لتحديد عدد الأجيال ، استخدم الصيغة: (logC- logI) / 0.301.
- جهاز طرد مركزي عند 5,000 × جم لمدة 20 دقيقة وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من 50 ملي مولار من هيدروكلوريد تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان هيدروكلوريد (Tris-HCl) ، درجة الحموضة 7.6 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم. لاختراق الخلايا ، أضف 2-3 قطرات من الكلوروفورم والدوامة لمدة 20 ثانية.
- حدد نشاط β-glucosidase لكل حصة في صفيحة دقيقة مكونة من 96 بئرا ، باستخدام p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (PNPGluc) كركيزة. أضف إلى كل بئر 100 ميكرولتر من الخلايا المنفذة و 100 ميكرولتر من الركيزة (محلول مخزون 16 مجم / مل في الماء أو H2O). احرص على تجنب فقاعات الهواء في الآبار. اقرأ الامتصاص عند 420 نانومتر ، باستخدام قارئ صفيحة دقيقة والفلتر المناسب.