استخراج وتنقية الجلوبولات البلاستوبولية من بكتيريا التمثيل الضوئي

الملخص

المصدر: Shivaiah, K., et al. عزل قطرات دهون Plastoglobule من أنسجة أوراق النبات والبكتيريا الزرقاء. J. Vis. خبرة. (2022)

يوضح الفيديو عزل البلوبولات من البكتيريا الزرقاء. يبدأ بثقافة البكتيريا الزرقاء ويستمر من خلال تعطيل الخلايا باستخدام القوة الميكانيكية. يشير إطلاق أصباغ التمثيل الضوئي إلى التحلل الناجح. ثم يتم استخدام تدرج خطوة السكروز لفصل المكونات الخلوية حسب الكثافة ، مما يسمح للكريات البلاستوبلية منخفضة الكثافة بتشكيل نطاق مميز في الأعلى. يتم جمع هذا الكسر وحفظه لمزيد من التحليل.

البروتوكول

1. عزل البلاستوغلوبول الخام

1. استخراج الجلوبول الخام من البكتيريا الزرقاء
   1. قم بزراعة 50 مل من Synechocystis sp. PCC 6803 إلى المرحلة الثابتة (حوالي 7-10 أيام) واضبط كثافة الخلية على كثافة بصرية عند 750 نانومتر (OD₇₅₀) من 2.0 باستخدام مقياس الطيف الضوئي. بالنسبة لظروف الاستزراع ، استخدم وسائط BG-11 وتنمو في حاضنة بكثافة ضوء تبلغ 150 ميكرولتر فوتونات / م² / ثانية ، 2٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، 32 درجة مئوية ، ومع اهتزاز مستمر عند 150 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة).
   2. لإزالة السكريات ، اغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي للمزرعة 50 مل عند 6,000 × جم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية ثم إزالة المادة الطافية. استمر بغسل الخلايا مرتين في 50 مل من المخزن المؤقت A (الجدول 1). قم بإزالة جزء من تجانس الخلية وضعه جانبا قبل الطرد المركزي ليتم تخزينه كعينة خلية إجمالية تمثيلية
   3. أعد تعليق الحبيبات المغسولة في 25 مل من Buffer A وكسر الخلايا باستخدام خلية ضغط فرنسية عند 1,100 رطل لكل بوصة مربعة (رطل لكل بوصة مربعة) ، وكرر العملية 3× (ضع العينة على الجليد بين كل دورة لتجنب تمسخ البروتين) حتى يتغير اللون المتحلل من الأخضر إلى الأحمر والأزرق والأخضر تحت الضوء الأبيض. استخدم خلية مبردة مسبقا وقم بتنفيذ هذه الخطوة في الغرفة الباردة.
   4. قم بتوزيع التجانس الناتج بين ثمانية أنابيب طرد مركزي فائقة سعة 3 مل مملوءة بحد أقصى 2.5 مل في كل أنبوب ثم تراكب بعناية ب 400 ميكرولتر من R المتوسط ، مما ينتج عنه تدرج خطوة.
   5. قم بموازنة الأنابيب بعناية عن طريق إضافة متوسط R إضافي ، حسب الضرورة ، وجهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 150,000 × جم عند 4 درجات مئوية. سوف تتكاثر الثايلاكويد والعضيات الأثقل الأخرى (بما في ذلك أي أجسام بولي هيدروكسي ألكانوات) ، بينما ينظر إلى الجلويات البلاستوكولوتية بسهولة على أنها وسادة صفراء زيتية على الجزء العلوي من تدرج السكروز أو بالقرب منه (الشكل 1 ج).
   6. احصد الوسادة العائمة الناتجة من الكلويات الأرضية الخام بحقنة وإبرة 22 جرام وقم بإيداعها في أنبوب سعة 2 مل. اكشط البلوبولات من جانب جدار أنبوب الطرد المركزي الفائق بطرف الإبرة إذا لزم الأمر.
   7. تابع إلى الخطوة 2.2. بدلا من ذلك ، قم بتخزين الكريات الأرضية الخام عند -80 درجة مئوية وتنقيتها لاحقا.

الجدول 1: وصفات عازلة لعزل الجلوبول البلاستوكولوبولي من أنسجة أوراق النبات أو البكتيريا الزرقاء.

التراكيب العازلة أ
طحن العازلة	50 ملي مولار هيبس كوه (درجة الحموضة 8.0)
	5 مللي مولار كلوريد المغنيسيوم (MgCl2)
	100 ملي سوربيتول
	5 ملي مولار حمض الأسكوربيك ب
	5 ملي مولار سيستين ب مخفضة
	0.05 ٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل البقر (BSA) ب
متوسط R	50 ملي مولار هيبس كوه (درجة الحموضة 8.0)
	5 ملي MgCl2
متوسط R 0.2	50 ملي مولار هيبس كوه (درجة الحموضة 8.0)
	5 ملي MgCl2
	0.2 مليون سكروز
متوسط R 0.7	50 ملي مولار هيبس كوه (درجة الحموضة 8.0)
	5 ملي MgCl2
	0.7 مليون سكروز
المخزن المؤقت أ	25 ملي مولار هيبس كوه (درجة الحموضة 7.8)
	250 ملي سكروز
a. يتم توفير التركيزات النهائية لكل مكون من مكونات العازلة.
b. يجب إضافته طازجا في يوم العزل. بينما يمكن تحضير المخازن المؤقتة في اليوم السابق للعزل ، يجب إضافة بعض المكونات طازجة في يوم العزل ، بالإضافة إلى أي مثبطات للفوسفاتيز والبروتياز

2. حصاد الكريات البلاستوبولية النقية

1. معالجة البكتيريا الزرقاء
   1. أنتج تدرج السكروز في أربعة أنابيب طرد مركزي فائقة سعة 2.5 مل ، طبقات أولا مع 500 ميكرولتر من الجلويات الأرضية الخام من الخطوة 1.3 ممزوجة ب 750 ميكرولتر من R 0.7 متوسط ، ثم تراكب ب 750 ميكرولتر من R 0.2 متوسط.
   2. قم بالطرد المركزي لتدرج السكروز عند 150,000 × جم لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع الكريات البتلازمية النقية (الشكل 1 ج) بحقنة وإبرة 22 جم من المرحلة العلوية من تدرج السكروز ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل.
   3. Aliquot الجلوبولات البلاستوبولية النقية والتجميد السريع في النيتروجين السائل. يحفظ مباشرة في درجة حرارة -80 درجة مئوية أو يحفظ التجميد إلى مسحوق جاف.

النتائج

الشكل 1: عزل ونشاف مناعي للغلويات البروستافية والثايلاكويدات. (أ) عينة تمثيلية من الجلوبول المنقى من Z. mays قبل استخراجها من تدرج السكروز. (ب) عينة ممثلة من الجلوبول الخام من بكتريا النيندينسيس

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الأسكوربات	دينار بحريني	BDH9242
مصل الأبقار الألبومين	Proliant البيولوجية	68700
خلية الضغط الفرنسية (موديل FA-079)	SLM / أمينكو	غير متاح
HEPES	سيجما ألدريتش	[إتش3375]
كلوريد المغنيسيوم	سيجما ألدريتش	م 8266
حاضنة اهتزاز Multitron	إنفورس HT	غير متاح
هيدروكسيد البوتاسيوم	فيشر للكيماويات	م 16050
انخفاض السيستين	MP الكيماويات الحيوية	101444
السوربيتول	سيجما ألدريتش	ط3889
سكروز	سيجما ألدريتش	س 9378
Synechocystis sp. PCC 6803	غير متاح	غير متاح
جهاز الطرد المركزي الفائق Optima MAX-TL	بيكمان كولتر	أ 95761