تقييم الاستعمار البكتيري المعوي في C. elegans الخالية من الجراثيم

الملخص

المصدر: تايلور ، إم إن ، et.al. استخدام بيانات دودة واحدة لتحديد عدم التجانس في Caenorhabditis elegans التفاعلات البكتيرية. J. Vis. خبرة. (2022)

يوضح هذا الفيديو تعرض ديدان Caenorhabditis الخالية من الجراثيم والمطابقة للعمر لسلالة بكتيرية للاستعمار المعوي. وهو يفسر الإزالة الانتقائية للبكتيريا الخارجية وغير الملتصقة ، تاركا فقط البكتيريا القابلة للحياة الملتصقة بظهارة الأمعاء لقياسها.

البروتوكول

1. تغذية الديدان على البكتيريا الحية في الثقافة السائلة

ملاحظه: يستخدم هذا البروتوكول لاستعمار الديدان مع البكتيريا المزروعة في المختبر في ظروف مختلطة جيدا في الثقافة السائلة. يمكن استعمار الديدان بعزلات فردية من الثقافة النقية (على سبيل المثال ، مسببات الأمراض مثل المكورات المعوية البرازية) أو مخاليط من العزلات (على سبيل المثال ، الحد الأدنى من مجتمعات الميكروبيوم).

1. ابدأ بالديدان البالغة المتزامنة المغسولة بالسكروز في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. اغسل الديدان مرة واحدة في 12 مل من المخزن المؤقت S وتخلص من المادة الطافية.
2. أعد تعليق الديدان المغسولة في حجم الوسط S اللازم للتجربة. ضع في اعتبارك حجم الظروف التجريبية ، وعدد الحالات التي سيتم تقسيم الديدان عليها ، والتركيزات النهائية للديدان والبكتيريا.
   ملاحظه: تختلف التغذية في الديدان باختلاف توافر البكتيريا ويمكن أن تتعرض الديدان للإجهاد بسبب الازدحام. للاستعمار في الثقافة السائلة ، يوصى باستخدام <1000 ديدان / مل و >10⁷ CFU / مل ؛ 10¹¹ CFU / مل تعتبر كثافة التغذية "ad libitum" على الإشريكية القولونية.
3. تدور الثقافات البكتيرية. صب من الفائق. يمكن استخدام الشفط أو سحب العينات لإزالة المادة الطافية للبكتيريا التي تشكل حبيبات فضفاضة.
   ملاحظه: بالنسبة للثقافات >5 مل ، انقله إلى أنابيب 15 مل وقم بالدوران عند ~ 2800 × جم في جهاز طرد مركزي كبير على الطاولة لمدة 8-10 دقائق. يمكن نقل الثقافات <5 مل إلى أنابيب سعة 1.5 مل وطردها بالطرد المركزي عند 9000 × جم لمدة 1-2 دقيقة في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة. قد تحتاج البكتيريا شديدة الحركة (على سبيل المثال ، العديد من أنواع الزائفة) إلى التبريد عند 4 درجات مئوية لمدة 10-15 دقيقة لتسهيل تكوين حبيبات مستقرة ، وقد يكون من الأفضل الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية.
4. أعد تعليق المزارع البكتيرية في مجلد واحد من المخزن المؤقت S وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى إلى الحبيبات. قم بإزالة المادة الطافية وتخلص منها كما كان من قبل.
5. أعد تعليق المزارع البكتيرية في وسط S بالكثافة المطلوبة للتجربة ، بالإضافة إلى أي مضادات حيوية للاختيار. تعتمد المضادات الحيوية المستخدمة ، إن وجدت ، على ملف مقاومة البكتيريا المستخدمة في الاستعمار.
6. باستخدام طرف ماصة مطلي بمحلول دودة M9 مكمل بنسبة 0.01٪ Triton X-100 (M9TX-01) ، تتحرك ديدان الماصة برفق لأعلى ولأسفل حتى يتم تعليق الديدان تماما في وسط S ، ثم تنتقل إلى الأنابيب أو آبار الألواح للاستعمار البكتيري.
7. أضف معلقا بكتيرييا إلى كل مزرعة دودة للوصول إلى التركيز البكتيري المطلوب والحجم النهائي.
8. إذا كنت تستخدم صفيحة متعددة الآبار للاستعمار ، فقم بتغطية اللوحة بغشاء مانع للتسرب معقم 96 بئرا نفاذية للغاز.
9. احتضان مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لمنع البكتيريا من الاستقرار أثناء الحضانة.

2. الاضطراب الميكانيكي للديدان الفردية بتنسيق 96 بئرا

ملاحظه: يصف هذا القسم بروتوكول تنسيق لوحة 96 بئرا للتعطيل الميكانيكي للفرد المستعمر بكتيريا C. ايليجان. تصف الخطوات الأولى في البروتوكول طريقة لتطهير البكتيريا غير الملتصقة من أمعاء الدودة وتنظيف الجزء الخارجي من الديدان باستخدام الشلل البارد وتبييض السطح. ستنتج هذه الخطوات ديدان بالغة نظيفة وحية يمكن تعطيلها ميكانيكيا لقياس محتويات البكتيريا أو استخدامها في مزيد من التجارب. يمكن تكييف هذا البروتوكول لتحديد كمية البكتيريا في الديدان المستعمرة في الثقافة السائلة ، أو على ألواح أجار ، أو من التربة الطبيعية أو الميكروية.

1. ضع حصة من M9TX-01 على الثلج لتبرد (4-5 أضعاف عدد العينات بالمل).
2. قم بإعداد كمية من M9TX-01 + مبيض (6٪ هيبوكلوريت الصوديوم ، 1: 1000 أو 1: 2000 فولت / حجم ، 1 مل لكل عينة + 1 مل إضافي) وضعها على الثلج لتبرد.
3. أعد تعليق كل عينة دودة في 1 مل من M9TX-01 في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
4. أنابيب الدوران لفترة وجيزة (2-3 ثوان) في جهاز طرد مركزي صغير منخفض السرعة (2,000 × جم) عند 25 درجة مئوية للبالغين بيليه. ماصة من المادة الطافية وتخلص منها ، مع التأكد من عدم إزعاج حبيبات الدودة.
5. باستخدام الطرد المركزي ، اشطف الديدان مرتين ب 1 مل من M9TX-01 ، ثم مرة واحدة ب 1 مل من المخزن المؤقت للدودة M9 ، لتقليل البكتيريا الخارجية.
6. تطهير البكتيريا غير الملتصقة من أمعاء الدودة.
   1. أعد تعليق كل عينة من الديدان في 1 مل من S متوسط + 2x OP50 المقتول بالحرارة في أنبوب مزرعة.
   2. احتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة للسماح بمرور أي بكتيريا غير ملتصقة من الأمعاء.
      ملاحظه: سيؤدي ذلك أيضا إلى تطهير أي بروتين فلوري خارج الخلية من التجويف والسماح بتصور أوضح للبكتيريا المصنفة الملتصقة بظهارة الأمعاء ، خاصة عند استخدام الفلوروفورات سريعة الحمض (على سبيل المثال ، mCherry ، dsRed).
7. ديدان التبييض السطحية لإزالة البكتيريا الخارجية.
   1. اشطف الديدان المطهرة مرتين ب 1 مل من M9TX-01 البارد وتخلص من المادة الطافية.
   2. اترك الأنابيب تبرد لمدة 10 دقائق على الثلج (يفضل) أو عند 4 درجات مئوية. سيؤدي ذلك إلى شل الديدان ومنع ابتلاع المبيض.
      ملاحظه: تستخدم البروتوكولات الأخرى عامل شلل كيميائي مثل ليفاميزول. هذا نهج راسخ يتطلب إضافة مجرى نفايات خطرة.
   3. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للدودة M9 المثلج + مبيض غير معطر (8.25٪ هيدروكسيد الصوديوم ، 1: 1000 أو 1: 2000 فولت / حجم) لكل أنبوب. اترك الأنابيب تجلس على الثلج (يفضل) أو عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل لقتل البكتيريا الخارجية.
      ملاحظه: لا تتجاوز تركيز 1: 1000 من المبيض. حتى في الديدان المشلولة ، يمكن أن ينتج عن ذلك الوفيات.
   4. ماصة قبالة عازلة التبييض والتخلص منها ؛ أعد الأنابيب إلى الجليد لضمان عدم استئناف الديدان الضخ حتى يتم إزالة المبيض.
   5. أضف 1 مل من M9TX-01 البارد إلى كل أنبوب. تدور لمدة ~ 5 ثوان في جهاز طرد مركزي صغير (2,000 × جم عند 25 درجة مئوية) ؛ إعادة الأنابيب إلى الجليد. قم بإزالة المادة الطافية وتخلص منها.
   6. كرر خطوة الشطف هذه ب 1 مل أخرى من M9TX-01 البارد ، مع التخلص من أكبر قدر ممكن من المادة الطافية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مبيض تجاري 8.25٪ هيبوكلوريت الصوديوم	كلوركس
كلوريد الكالسيوم ثنائي الهيدرات	فيشر العلمية	AC423525000
كولسترول	VWR	AAA11470-30
أحادي هيدرات حامض الستريك	فيشر العلمية	AC124910010
النحاس (II) كبريتات خماسي الهيدرات	فيشر العلمية	AC197722500
كورنينج 6765 LSE جهاز طرد مركزي صغير	كورنينج	كور -6765
أنابيب الطرد المركزي الدقيق Eppendorf سعة 1.5 مل ، طبيعية	إيبندورف
جهاز طرد مركزي دقيق Eppendorf 5424R	إيبندورف	5406000640	جهاز طرد مركزي دقيق مبرد على الطاولة من 24 مكانا
جهاز طرد مركزي Eppendorf 5810R مع دوار S-4-104	إيبندورف	22627040	جهاز طرد مركزي 3 لتر مع محولات لأنابيب وألواح 15-50 مل
دلو لوحة Eppendorf (x2) ، للدوار S-4-104	إيبندورف	22638930
الإيثانول 100٪	فيشر العلمية	BP2818500
كبريتات الحديد (II) هيبتاهيدرات	فيشر العلمية	423731000
كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات	فيشر العلمية	AC124900010
كلوريد المنغنيز (II) رباعي الهيدرات	VWR	470301-706
الببتون	فيشر العلمية	BP1420-500
محلول ملحي مخزن بالفوسفو (1X PBS)	السيرة الذاتية الذهبية	ف-271-200
صينية الأوتوكلاف البولي بروبلين ، ضحلة	فيشر العلمية	13-361-10
هيدروكسيد البوتاسيوم	فيشر العلمية	AC134062500
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة	فيشر العلمية	BP363-1
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة	فيشر العلمية	BP362-1
ملعقة مختبر من نوع المغرفة ، معدن	VWR	470149-438
هيدروكسيد الصوديوم	VWR	BDH7247-1
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة اللامائي	فيشر العلمية	BP332-500
كلوريد الصوديوم	فيشر العلمية	BP358-1
ثلاثي البوتاسيوم سترات مونوهيدرات	فيشر العلمية	AC611755000
تريتون X-100	فيشر العلمية	BP151-100
كبريتات الزنك سباعي الهيدرات	فيشر العلمية	AC205982500