التعطيل الميكانيكي للديدان الفردية لتقييم التباين في تفاعلات البكتيريا المضيفة

الملخص

المصدر: تايلور ، إم إن وآخرون. استخدام بيانات دودة واحدة لتحديد عدم التجانس في Caenorhabditis elegans التفاعلات البكتيرية. J. Vis. خبرة. (2022)

يوضح هذا الفيديو التقدير الكمي لتقلب الحمل البكتيري المعوي في التهاب الزنجان الفردي من خلال الاضطراب الميكانيكي. يحدد خطوات تحضير العينة ، والتعطيل الميكانيكي ، والتخفيف التسلسلي ، وعد المستعمرات لتقييم الاختلافات في الحمل البكتيري المعوي بين الديدان الفردية.

البروتوكول

1. افصل الديدان إلى صفيحة عميقة بسعة 96 بئرا مع حبيبات كربيد السيليكون للتعطيل الميكانيكي. قم بإعداد لوحة التعطيل المكونة من 96 بئرا على النحو التالي.
   1. احصل على صفيحة معقمة سعة 2 مل بعمق 96 بئرا وغطاء صفيحة سيليكون مطابق 96 بئرا.
      ملاحظه: من المهم استخدام الألواح المتوافقة مع محولات 96 بئرا لاضطراب الأنسجة. تحدث الاختلافات الصغيرة في الأبعاد الخارجية فرقا بين اللوحة التي يمكن إزالتها من المحولات واللوحة التي لا يمكن إزالتها.
   2. باستخدام ملعقة مغرفة معقمة ، أضف كمية صغيرة من كربيد السيليكون المعقم 36 حبيبة رملية إلى كل بئر من اللوحة التي ستتلقى دودة. استخدم ما يكفي من الحصى لتغطية قاع البئر بالكاد (حوالي 0.2 جرام لكل بئر). ستجعل المواد الزائدة من الصعب الحصول على طرف ماصة في قاع البئر عند استرداد المحتويات.
   3. أضف 180 ميكرولتر من المخزن المؤقت للدودة M9 إلى كل بئر.
   4. قم بتسمية الأعمدة أو الصفوف للإشارة إلى المكان الذي ستذهب إليه كل عينة ، ثم قم بتغطية اللوحة بشكل غير محكم بغطاء لوحة السيليكون 96 بئرا.
2. انقل الديدان الفردية إلى لوحة 96 بئرا للتعطيل.
   1. انقل الديدان المنفذة بعناية إلى طبق بتري صغير (35 أو 60 مم) يحتوي على ما يكفي من المخزن المؤقت للدودة M9 مكملا ب 0.01٪ Triton X-100 (M9TX-01) لملء الطبق حتى عمق ~ 1 سم.
      ملاحظه: في حالة وجود عدد كبير من الديدان ، فقد لا يكون من الممكن نقل العينة بأكملها لأن السائل سيصبح مزدحما ، وسيكون من الصعب ماصة الديدان الفردية.
   2. باستخدام مجهر تشريح أو أي جهاز آخر منخفض التكبير، قم بإزالة الديدان الفردية بأحجام 20 ميكرولتر وانقل هذه الديدان إلى الآبار الفردية للوحة المكونة من 96 بئرا.
      ملاحظه: من الأفضل حصاد الديدان المقتولة حديثا فقط. تجنب الديدان ذات الشكل الخطي الصلب ، لأن هذه الديدان قد تكون ميتة لبعض الوقت. حاول أن تأخذ الديدان المنحنية أو على شكل حرف S ، مع فسيولوجيا إجمالية طبيعية وأمعاء سليمة.
   3. بعد نقل كل وحدة تخزين ، تأكد من أن الدودة المحددة قد تم إخراجها بالفعل في البئر. للقيام بذلك ، قم بسحب 20 ميكرولتر من M9TX-01 من منطقة واضحة من طبق بتري وتحرير الحجم الكامل مرة أخرى في الطبق ؛ سيؤدي هذا عادة إلى إخراج الدودة إذا كانت عالقة في الماصة. إذا كانت الدودة عالقة ، فقم بإزالة 20 ميكرولتر من البئر وحاول النقل مرة أخرى.
   4. بمجرد نقل جميع الديدان ، قم بتغطية اللوحة المكونة من 96 بئرا بورقة من فيلم الختم المرن المدعوم بالورق المتوفر تجاريا (مربعات 2 × 2) ، مع التأكد من أن الجانب المدعوم بالورق من فيلم الختم متجها لأسفل على آبار العينة. احرص على عدم تمديد فيلم الختم بشكل رقيق جدا ، وإلا سيكون من الصعب جدا إزالته لاحقا.
   5. ضع حصيرة الختم المصنوعة من السيليكون برفق فوق فيلم الختم المرن ؛ لا تضغط على الغطاء لأسفل في الآبار في هذا الوقت.
   6. انقل الطبق إلى 4 درجات مئوية ليبرد لمدة 30-60 دقيقة. سيمنع ذلك ارتفاع درجة الحرارة أثناء التعطيل ، مما قد يؤدي إلى إتلاف العينات.
      ملاحظه: هذه نقطة توقف في البروتوكول. في معظم الحالات ، يمكن ترك اللوحة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 ساعات قبل الطحن. لا تترك الديدان طوال الليل ، لأن ذلك سيغير عدد البكتيريا.
3. قم بتحميل صفيحة 96 بئرا على مزعج الأنسجة لتفتيت أنسجة الدودة وإطلاق البكتيريا المعوية.
   ملاحظة: (اختياري) في حالة استخدام عدد فردي من ألواح 96 بئرا للهضم ، فمن الضروري إعداد ثقل موازن قبل المتابعة. استخدم طبقا فارغا عميقا مكون من 96 بئرا واملأ الآبار بالماء حتى يزن نفس وزن الطبق الأول.
   1. اضغط على حصيرة ختم السيليكون بقوة في الآبار لإنشاء ختم ، مع التأكد من أن الغطاء مسطح على كامل سطح اللوحة.
      ملاحظه: إذا كان فيلم الختم المرن سميكا جدا بعد التمدد ، فسيكون من الصعب تأمين غطاء السيليكون بحيث يكون مسطحا في جميع الآبار. سيؤدي ذلك إلى عدم كفاية الختم والتلوث من البئر إلى البئر أثناء الرج.
   2. قم بتأمين الألواح في مزعج الأنسجة باستخدام محولات الألواح ذات 96 بئرا. رج الألواح لمدة 1 دقيقة عند 30 هرتز ، ثم قم بتدوير الألواح 180 درجة ورجها مرة أخرى لمدة 1 دقيقة. سيساعد ذلك في ضمان اضطراب متساو في جميع آبار اللوحة.
   3. اضغط على الألواح بقوة على المقعد مرتين أو ثلاث مرات لإخراج أي حبيبات من فيلم الختم المرن.
   4. باستخدام جهاز طرد مركزي كبير مع محولات لوحة 96 بئرا ، قم بتدوير الألواح لأسفل عند 2400 × جم لمدة دقيقتين لتجميع كل المواد في قاع الآبار.
   5. قم بإزالة غطاء السيليكون واسحب فيلم الختم المرن بعناية.
      ملاحظه: إذا التصق فيلم الختم المرن بأي من الآبار ، فاستخدم طرف ماصة 200 ميكرولتر لإزالته. هذا شائع عندما يتم شد فيلم الختم المرن بشكل رقيق جدا.
4. عينات هضم الديدان المخففة بشكل متسلسل في 300 ميكرولتر في ألواح 96 بئرا.
   1. باستخدام ماصة متعددة الآبار مضبوطة على 200 ميكرولتر، قم بسحب الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات ببطء وحذر لإعادة خلط محتويات الآبار، ثم سحب أكبر قدر ممكن من السائل. انقل هذا السائل إلى الصفوف العليا من الألواح المكونة من 96 بئرا المعدة للتخفيف التسلسلي لعينات الديدان المعطلة.
   2. باستخدام ماصة ذات 96 بئرا مضبوطة على 20 ميكرولتر، قم بإزالة هذا الحجم من السائل من الصف العلوي ووزعها في الصف B. ماصة لأعلى ولأسفل 8-10x للخلط. تجاهل النصائح.
   3. كرر الخطوة 4.2، بدءا من عينات 0.1x في الصف B لإنشاء عينات تخفيف 0.01x في الصف C.
   4. كرر الخطوة 4.2 مرة أخرى ، بالانتقال من الصف C إلى الصف D.
   5. صفيحة على أجار صلب لقياس البكتيريا. بالنسبة للديدان أحادية الاستعمار ، يكفي عموما وضع قطرات 10-20 ميكرولتر من كل تخفيف [1x-0.001x] على ألواح أجار. للاستعمار متعدد الأنواع، قم بوضع كل مخفف على حدة عن طريق سحب 100 ميكرولتر على لوح أجار مقاس 10 سم. انتشر على الفور باستخدام حبات الطلاء الزجاجي.

المواد