القياس الكمي للقطبية وديناميكيات مكون نظام الإفراز في الفيلقية الرئوية

الملخص

المصدر: Chetrit, D., et al. تطبيق تصوير الخلايا الحية والتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد لحل السمات الزمانية المكانية لنظام إفراز Legionella pneumophila dot / icm. J. Vis. خبرة. (2020)

يوضح هذا الفيديو استخدام التصوير الفلوري للخلايا الحية لتحديد قطبية وديناميكيات مكونات نظام الإفراز في الفيلقية الرئوية ، مما يتيح تحليل التجنيد المكاني وإعادة توزيع العصارة الخلوية أمر بالغ الأهمية لفهم التسبب في البكتيريا

البروتوكول

1. القياس الكمي للتوطين القطبي وديناميكيات مكونات Dot / Icm

ملاحظه: تم تصميم الخطوات التالية للصور التي تبلغ 0.129 ميكرومتر لكل بكسل والتي تم الحصول عليها باستخدام تجميع 2 × 2.

1. القياس الكمي للقطبية لبروتينات الاندماج sfGFP (البروتين الفلوري الأخضر فائق) (الشكل 1)
   1. اضبط تباين الصورة بحيث تكون البكتيريا مرئية بوضوح. استخدم أداة المنطقة لوضع مستطيل 0.25 × 1.3 ميكرومتر² يبدأ من القطب ويمتد إلى السيتوبلازم. يجب أن يظل المستطيل بدقة داخل الحدود البكتيرية.
   2. ضع علامة على 200 بكتيريا على الأقل واستخدم زر المنطقة إلى القناع لإنشاء أقنعة للمناطق ذات الاهتمام. ضمن إحصائيات القناع ونطاق القناع، اختر كائن. ثم ، ضمن الميزات والكثافة ، ضع علامة على متوسط الكثافة والتباين.
   3. تصدير البيانات وحساب درجات القطبية لكل بكتيريا كنسبة بين التباين إلى متوسط الكثافة.
   4. بالنسبة للتطبيقات عالية الإنتاجية ، استخدم هدف الطور وإعداد مكثف مناسب للحصول على صور مع قنوات الطور و 488 نانومتر. تأكد من اختيار مجالات الرؤية حيث يتم فصل البكتيريا تماما.
   5. اضبط تباين قناة الطور للصورة على مستوى تكون فيه البكتيريا مرئية بوضوح. افتح صورة القناة المزدوجة ، وقم بتشغيل نافذة إنشاء قناع مقطع وقم بتغيير القناة إلى مرحلة.
   6. اضبط عتبة مناسبة وقم بإزالة الكائنات الصغيرة باستخدام الزر Define Objects . ضمن Refine Mask، اختر Remove Edges Objects، ثم افصل أقنعة البكتيريا المتجاورة لبعضها البعض لاحقا.
   7. احسب درجات قطبية الإشارة في القناة 488 لكل خلية كما هو موضح سابقا في الخطوات 1.1.2-1.1.3.
2. القياس الكمي لديناميكيات بروتينات اندماج sfGFP (الشكل 2)
   ملاحظه: تعرف الديناميكيات على أنها تغيرات في الشدة بمرور الوقت ، ويتم تصميم الخطوات التالية لفترات تصوير قصيرة (أي عدة دقائق). أضف إلى الوسادة المكملات المناسبة إذا كانت فترات التصوير الأطول مطلوبة.
   1. في نافذة التقاط الصور ، ضع علامة على الفاصل الزمني، وأدخل وقت الفواصل الزمنية في مربع الفاصل الزمني، وأدخل 2 في المربع # من النقاط الزمنية . احصل على صورتين متتاليتين ل Legionella pneumophila تعبر عن البروتين الفلوري محل الاهتمام.
   2. اضبط تباين الصورة حتى تصبح الخلايا مرئية بوضوح. اتبع الشكل 2 أ والأوصاف أدناه لوضع ثلاثة أقنعة مختلفة. استخدم أداة المنطقة لوضع مربع 0.25 × 0.25 ميكرومتر في منتصف 400 خلية على الأقل.
   3. استخدم الزر Region to Mask لإنشاء قناع (قناع 1) للمربعات ذات الأهمية. قم بإنشاء قناع فارغ جديد (القناع 2) واستخدم أداة البكسل أو أداة المضلع لتمييز مساحة الخلية بأكملها لما لا يقل عن 25 خلية عشوائية ، والتي سيتم استخدامها لحساب التبييض الفلوري. قم بإنشاء قناع فارغ جديد (القناع 3) واستخدم أداة الفرشاة الكبيرة لتمييز المناطق بين الخلايا ، والتي سيتم استخدامها لطرح الخلفية.
   4. ضمن Mask Statistics and Mask Scope، اختر Object للقناع 1 والقناع 2. بعد ذلك، ضمن الميزات والكثافة، اختر متوسط الكثافة وقم بتصدير بيانات القناعين. بالنسبة للقناع 3، قم بتصدير متوسط شدة القناع بأكمله.
   5. احسب التغير في شدة التألق لكل كائن في القناع 1 باستخدام الصيغ التالية:

حيث يكون القناع 1 مربعا بحجم 0.25 ميكرومتر × 0.25 ميكرومتر موضوعا في مركز الخلية ، ويغطي القناع 2 الخلية بأكملها ، والقناع 3 هو الخلفية بين الخلايا ، و T1 هو متوسط الشدة في النقطة الزمنية الأولى ، و T2 هو متوسط الشدة في النقطة الزمنية الثانية.

النتائج

الشكل 1: التقدير الكمي للتوطين القطبي للوحدات الفرعية لنظام Dot / Icm. (أ) أظهر التصور في الوقت الحقيقي ل DotB-sfGFP المعبر عنه في Lp01 توطين قطبي. عرض DotB-sfGFP نمطا منتشرا عند التعبير عنه في سلالة حيث تم حذف مجموعة...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
هدف 100x خطة Apo (1.4 NA)	نيكون
كاميرا رقمية أحادية اللون CoolSNAP EZ 20 ميجاهرتز	القياسات الضوئية
شرائح غطاء المجهر 22x22 مم	فيشر العلمية	12-542 ب
شرائح غطاء المجهر 24x50 مم	فيشر العلمية	12-545 ك
شرائح مجهر 25x75x1 مم	غلوب ساينتفيك	1380
دفتر الشرائح 6.0	ابتكارات التصوير الذكي
محرك الضوء Spectra X	لومينكور