$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. القياس الكمي للتوطين القطبي وديناميكيات مكونات Dot / Icm
ملاحظه: تم تصميم الخطوات التالية للصور التي تبلغ 0.129 ميكرومتر لكل بكسل والتي تم الحصول عليها باستخدام تجميع 2 × 2.
- القياس الكمي للقطبية لبروتينات الاندماج sfGFP (البروتين الفلوري الأخضر فائق) (الشكل 1)
- اضبط تباين الصورة بحيث تكون البكتيريا مرئية بوضوح. استخدم أداة المنطقة لوضع مستطيل 0.25 × 1.3 ميكرومتر2 يبدأ من القطب ويمتد إلى السيتوبلازم. يجب أن يظل المستطيل بدقة داخل الحدود البكتيرية.
- ضع علامة على 200 بكتيريا على الأقل واستخدم زر المنطقة إلى القناع لإنشاء أقنعة للمناطق ذات الاهتمام. ضمن إحصائيات القناع ونطاق القناع، اختر كائن. ثم ، ضمن الميزات والكثافة ، ضع علامة على متوسط الكثافة والتباين.
- تصدير البيانات وحساب درجات القطبية لكل بكتيريا كنسبة بين التباين إلى متوسط الكثافة.
- بالنسبة للتطبيقات عالية الإنتاجية ، استخدم هدف الطور وإعداد مكثف مناسب للحصول على صور مع قنوات الطور و 488 نانومتر. تأكد من اختيار مجالات الرؤية حيث يتم فصل البكتيريا تماما.
- اضبط تباين قناة الطور للصورة على مستوى تكون فيه البكتيريا مرئية بوضوح. افتح صورة القناة المزدوجة ، وقم بتشغيل نافذة إنشاء قناع مقطع وقم بتغيير القناة إلى مرحلة.
- اضبط عتبة مناسبة وقم بإزالة الكائنات الصغيرة باستخدام الزر Define Objects . ضمن Refine Mask، اختر Remove Edges Objects، ثم افصل أقنعة البكتيريا المتجاورة لبعضها البعض لاحقا.
- احسب درجات قطبية الإشارة في القناة 488 لكل خلية كما هو موضح سابقا في الخطوات 1.1.2-1.1.3.
- القياس الكمي لديناميكيات بروتينات اندماج sfGFP (الشكل 2)
ملاحظه: تعرف الديناميكيات على أنها تغيرات في الشدة بمرور الوقت ، ويتم تصميم الخطوات التالية لفترات تصوير قصيرة (أي عدة دقائق). أضف إلى الوسادة المكملات المناسبة إذا كانت فترات التصوير الأطول مطلوبة.- في نافذة التقاط الصور ، ضع علامة على الفاصل الزمني، وأدخل وقت الفواصل الزمنية في مربع الفاصل الزمني، وأدخل 2 في المربع # من النقاط الزمنية . احصل على صورتين متتاليتين ل Legionella pneumophila تعبر عن البروتين الفلوري محل الاهتمام.
- اضبط تباين الصورة حتى تصبح الخلايا مرئية بوضوح. اتبع الشكل 2 أ والأوصاف أدناه لوضع ثلاثة أقنعة مختلفة. استخدم أداة المنطقة لوضع مربع 0.25 × 0.25 ميكرومتر في منتصف 400 خلية على الأقل.
- استخدم الزر Region to Mask لإنشاء قناع (قناع 1) للمربعات ذات الأهمية. قم بإنشاء قناع فارغ جديد (القناع 2) واستخدم أداة البكسل أو أداة المضلع لتمييز مساحة الخلية بأكملها لما لا يقل عن 25 خلية عشوائية ، والتي سيتم استخدامها لحساب التبييض الفلوري. قم بإنشاء قناع فارغ جديد (القناع 3) واستخدم أداة الفرشاة الكبيرة لتمييز المناطق بين الخلايا ، والتي سيتم استخدامها لطرح الخلفية.
- ضمن Mask Statistics and Mask Scope، اختر Object للقناع 1 والقناع 2. بعد ذلك، ضمن الميزات والكثافة، اختر متوسط الكثافة وقم بتصدير بيانات القناعين. بالنسبة للقناع 3، قم بتصدير متوسط شدة القناع بأكمله.
- احسب التغير في شدة التألق لكل كائن في القناع 1 باستخدام الصيغ التالية:
حيث يكون القناع 1 مربعا بحجم 0.25 ميكرومتر × 0.25 ميكرومتر موضوعا في مركز الخلية ، ويغطي القناع 2 الخلية بأكملها ، والقناع 3 هو الخلفية بين الخلايا ، و T1 هو متوسط الشدة في النقطة الزمنية الأولى ، و T2 هو متوسط الشدة في النقطة الزمنية الثانية.
