تحضير الفيلقية الرئوية للتصوير المقطعي الإلكتروني المبرد

الملخص

المصدر: Chetrit, D., et al. تطبيق تصوير الخلايا الحية والتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد لحل السمات الزمانية المكانية لنظام إفراز Legionella pneumophila dot / icm. J. Vis. خبرة. (2020)

يصف الفيديو كيفية تحضير عينات الفيلقية الرئوية للتصوير المقطعي بالتبريد الإلكتروني من خلال الجمع بين الاستزراع البكتيري وعلامات الجسيمات النانوية الذهبية وتقنيات التزجيج. تحافظ العملية على الهياكل الخلوية الأصلية وتمكن من التصوير عالي الدقة لمكونات نظام الإفراز المرتبط بالغشاء.

البروتوكول

1. الكشف عن كثافة كتلة sfGFP باستخدام Cryo-ET

1. إعداد العينات وجمع البيانات وإعادة الإعمار

1. قم بزراعة رقعة ثقيلة من الفيلقية الرئوية التي تعبر عن بروتين Dot / Icm الموسوم بالفلورسنت على ألواح CYE-agar-streptomycin لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية. أعد تعليق الخلايا في ddH₂O إلى OD₆₀₀ من 0.7. أضف 5 ميكرولتر من جزيئات الذهب الغروية (BSA Tracer ، 10 نانومتر) إلى 20 ميكرولتر من تعليق الخلية.

2. ماصة 5 ميكرولتر من خليط الخلية على شبكة كربون ثقب متوهجة حديثا (R 2/1 على شبكة Cu 200) واتركها لمدة 1 دقيقة. وصمة عار بورق الترشيح وقم بتجميدها في الإيثان السائل باستخدام جهاز مكبس مدفوع بالجاذبية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
جزيئات الذهب الغروية 10 نانومتر	أوريون	25486
هدف 100x خطة Apo (1.4 NA)	نيكون
اسات	سيجما ألدريتش	أ 9758
كاميرا رقمية أحادية اللون CoolSNAP EZ 20 ميجاهرتز	القياسات الضوئية
إطار الجينات، 1.7 × 2.8 سم، 125 ميكرولتر	فيشر العلمية	أب -0578
شبكة هولي الكربون R 2/1 Cu 200 شبكة	Quantifoil	س 225-CR1
نترات الحديد (III) nonahydrate	سيجما ألدريتش	216828
كاميرا K2 Summit ل cryo-EM	جاتان
شرائح غطاء المجهر 22x22 مم	فيشر العلمية	12-542 ب
شرائح غطاء المجهر 24x50 مم	فيشر العلمية	12-545 ك
شرائح مجهر 25x75x1 مم	غلوب ساينتفيك	1380
دفتر الشرائح 6.0	ابتكارات التصوير الذكي
محرك الضوء Spectra X	لومينكور