زراعة بكتيريا الضمة الطبيعية سريعة النمو

الملخص

المصدر: Wiegand ، D.J. ، Lee ، et al. ، تعبير البروتين الخالي من الخلايا باستخدام بكتيريا الضمة الطبيعية سريعة النمو. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو زراعة وحصاد Vibrio natriegens ، وهي بكتيريا سريعة النمو ، في ظل ظروف تهوية لتحضير الكريات البكتيرية لتوليد المستخلصات الخام.

البروتوكول

تحضير مستخلص الخلايا الخام Vibrio natriegens - الثقافة البكتيرية

1. تحضير V. natriegens وسائط نمو البكتيريا LB-V2 (مرق ليسوجيني مع أملاح V2) وفقا للجدول 1. تعقيم وسائط النمو عن طريق التعقيم. اسمح للوسائط بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة (RT). قم بتخزين الوسائط الزائدة في RT.
   أنذر: ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) واستشر التعليمات الخاصة بالمختبر عند تشغيل الأوتوكلاف.
2. استخدم مخزون الجلسرين من النوع البري V. natriegens لتلقيح 3 مل من وسائط LB-V2. تنمو طوال الليل عند 30 درجة مئوية بينما تهتز عند 225 دورة في الدقيقة.
3. اغسل 1 مل من المزرعة الليلية عن طريق الطرد المركزي عند 10,600 × جم على جهاز طرد مركزي على الطاولة لمدة دقيقة واحدة. استنشق المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات الناتجة وأعد تعليقه في 1 مل من وسائط LB-V2 الطازجة.
4. في قارورة Erlenmeyer محيرة سعة 4 لتر مع غطاء معقم ، أضف 1 لتر من وسائط النمو LB-V2 الطازجة. التلقيح باستخدام 1 مل من المزرعة المغسولة طوال الليل (نسبة التخفيف 1: 1,000). تنمو الثقافة عند 30 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: يمكن توسيع نطاق مزارع V. natriegens لأعلى أو لأسفل مع الحفاظ على نسبة التخفيف 1: 1,000. على سبيل المثال ، أضف 250 ميكرولتر من المزرعة المغسولة طوال الليل إلى 250 مل من وسائط النمو الطازجة LB-V2 في قارورة Erlenmeyer محيرة سعة 2 لتر مع غطاء معقم.
5. راقب OD₆₀₀ الخاص بالثقافة باستخدام مقياس الطيف الضوئي. عندما تصل المزرعة إلى_{OD 600} = 1.0 ± 0.2 ، قم بزراعة الحصاد عن طريق الطرد المركزي عند 3,500 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ضع الحبيبات على الثلج.
   ملاحظة: ينمو V. natriegens بسرعة ، لذلك من الضروري المراقبة الدقيقة للثقافة. يجب أن يستغرق النمو إلى_{OD 600} = 1.0 حوالي 1.5-2 ساعة عند نسبة التخفيف 1: 1,000.
6. استنشق المادة الطافية وقم بتخزين الحبيبات البكتيرية الناتجة على الفور عند -80 درجة مئوية أو انتقل مباشرة إلى تحلل الخلايا.
   ملاحظه: هذه الخطوة هي نقطة توقف جيدة. ومع ذلك, يوصى بمعالجة الحبيبات على الفور أو في غضون 1-2 أيام للحصول على أفضل النتائج.

الجدول 1: الكواشف لتحضير 1 لتر من وسائط نمو البكتيريا LB-V2

الجدول 1 ألف	تحضير وسائط نمو البكتيريا LB-V2
مكون	الكمية (جم)	التركيز النهائي (ملي مولار)	المجلد النهائي (لتر)
مرق LB (ميلر)	25		1
كلوريد الصوديوم	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
KCl	0.31	4.2
الجدول 1 باء	تحضير S30A Lysis Buffer
مكون	الكمية (جم)	التركيز النهائي (ملي مولار)	المجلد النهائي (لتر)
محلول تريس (درجة الحموضة 8.0) - 1 م (مل)	25	50	0.5
ملغ-غلوتامات	2.72	14
K-غلوتامات	6.10	60
ديثيوثريتول (DTT) - 1 م (مل)	1	2

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أنابيب 2 مل	إيبندورف	22363352
HEPES (4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازين حمض إيثان سلفونيك)	سيغما	[إتش3375]
مرق LB (لوريا بيرتاني) (ميلر)	سيغما	L3522
كلوريد المغنيسيوم (MgCl₂)	سيغما	م 8266
كلوريد البوتاسيوم (KCl)	سيغما	ص 9333
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)	سيغما	س7653
محلول تريس (درجة الحموضة 8.0) - 1 م	إنفيتروجين	AM9856
Vibrio natriegens (النوع البري) مخزون مجفف بالتجميد	ATCC	14048