تحضير مستخلص الخلايا الخام من Vibrio natriegens

الملخص

المصدر: Wiegand, D. J., et al. تعبير البروتين الخالي من الخلايا باستخدام بكتيريا الضمة الطبيعية سريعة النمو. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو تحضير مستخلص خلوي من Vibrio natriegens ، وهي بكتيريا سريعة النمو معروفة بمعدل تخليق البروتين العالي. يتم غسل الحبيبات البكتيرية وتعليقها في عازلة التحلل قبل الصوتنة على الجليد لمنع التدهور الخلوي. يتم طرد المحلل لفصل بقايا الخلايا غير القابلة للذوبان ، ويتم جمع مستخلص الخلية وتجميدها وتخزينها لاستخدامها في المستقبل.

البروتوكول

1. تحضير مستخلصات الخلايا الخام V. natriegens - الثقافة البكتيرية

1. قم بإعداد V . natriegens وسائط النمو البكتيري ، مرق ليسوجين الإصدار 2 (LB-V2) وفقا للجدول 1. تعقيم وسائط النمو عن طريق التعقيم. اسمح للوسائط بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة (RT). قم بتخزين الوسائط الزائدة في RT.
   أنذر: ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) واستشر التعليمات الخاصة بالمختبر عند تشغيل الأوتوكلاف.
2. استخدم مخزون الجلسرين من النوع البري V. natriegens لتلقيح 3 مل من وسائط LB-V2. تنمو طوال الليل عند 30 درجة مئوية بينما تهتز عند 225 دورة في الدقيقة.
3. اغسل 1 مل من المزرعة الليلية عن طريق الطرد المركزي عند 10,600 × جم على جهاز طرد مركزي على الطاولة لمدة دقيقة واحدة. استنشق المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات الناتجة وأعد تعليقه في 1 مل من وسائط LB-V2 الطازجة.
4. في قارورة Erlenmeyer محيرة سعة 4 لتر معقمة بغطاء معقم ، أضف 1 لتر من وسائط النمو LB-V2 الطازجة. التلقيح باستخدام 1 مل من المزرعة المغسولة طوال الليل (نسبة التخفيف 1: 1,000). تنمو الثقافة عند 30 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: يمكن توسيع نطاق مزارع V. natriegens لأعلى أو لأسفل مع الحفاظ على نسبة التخفيف 1: 1,000. على سبيل المثال ، أضف 250 ميكرولتر من المزرعة المغسولة طوال الليل إلى 250 مل من وسائط النمو الطازجة LB-V2 في قارورة Erlenmeyer محيرة سعة 2 لتر مع غطاء معقم.
5. راقب OD₆₀₀ الخاص بالثقافة باستخدام مقياس الطيف الضوئي. عندما تصل المزرعة إلى_{OD 600} = 1.0 ± 0.2 ، قم بزراعة الحصاد عن طريق الطرد المركزي عند 3,500 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ضع الحبيبات على الجليد.
   ملاحظة: ينمو V. natriegens بسرعة ، لذلك من الضروري المراقبة الدقيقة للثقافة. يجب أن يستغرق النمو إلى_{OD 600} = 1.0 حوالي 1.5-2 ساعة عند نسبة التخفيف 1: 1,000.
6. استنشق المادة الطافية وقم بتخزين الحبيبات البكتيرية الناتجة على الفور عند -80 درجة مئوية أو انتقل مباشرة إلى تحلل الخلية الموضح في القسم 2.
   ملاحظه: هذه الخطوة هي نقطة توقف جيدة. ومع ذلك, يوصى بمعالجة الحبيبات على الفور أو في غضون 1-2 أيام للحصول على أفضل النتائج.

2. تحضير مستخلصات الخلايا الخام V. natriegens - تحلل الخلايا

1. قم بإعداد المخزن المؤقت S30 للتحلل كما هو موضح في الجدول 1 في الماء المعقم منزوع الأيونات (DI) واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.7 باستخدام حمض الخليك الجليدي.
   أنذر: يجب التعامل مع حمض الأسيتيك الجليدي باستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند ضبط درجة الحموضة.
2. قم بتبريد المخزن المؤقت S30 للتحلل إلى حوالي 4 درجات مئوية في الثلاجة أو على الثلج قبل بدء إجراء تحلل الخلايا.
   ملاحظه: لتهدئة سريعة ، يمكن وضع المخزن المؤقت للتحلل عند -20 درجة مئوية. لا تدع المخزن المؤقت يتجمد.
3. ضع حبيبات الخلايا على الثلج لمدة 10-20 دقيقة أو حتى تذوب تماما. أعد تعليق جميع الكريات الناتجة عن نفس مزرعة 1 لتر باستخدام 10 مل من المخزن المؤقت للتحلل البارد S30 ، ثم انقل المعلق إلى أنبوب 50 مل. إذا لم يتم تجميد الكريات في الفريزر عند -80 درجة مئوية في الخطوة 1.6, انتقل مباشرة إلى إعادة التعليق.
   ملاحظه: قم بزيادة حجم المخزن المؤقت للتحلل S30 المستخدم لإعادة تعليق الكريات في البداية حسب الحاجة.
4. تعليق أجهزة الطرد المركزي عند 3,500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. اغسل الحبيبات مرة ثانية باستخدام 10 مل من المخزن المؤقت للتحلل البارد S30. ضع الحبيبات على الثلج.
5. في غرفة باردة ، أضف 500 ميكرولتر من مخزن تحلل S30 البارد إلى الحبيبات في أنبوب 50 مل. باستخدام طرف ماصة عريض التجويف, أعد تعليق الحبيبات وانقل تعليق الحبيبات بالكامل بعناية إلى أنبوب 2 مل.
   ملاحظه: في حالة عدم توفر ماصة عريضة التجويف، استخدم مقصا لقص نهاية طرف الماصة سعة 1 مل لزيادة التجويف لنقل الحبيبات.
   1. نقل أكبر قدر ممكن من الحبيبات دون زيادة الحجم بشكل كبير ؛ ومع ذلك, يجب إعادة تعليق الحبيبات في سائل كاف ليتم صوتنة, كما يتضح من تعليق متجانس في أنبوب 2 مل. لا تملأ أنبوب 2 مل أكثر من اللازم. يجب ألا يتجاوز التعليق 1.5 مل ؛ قسمها إلى أنابيب متعددة إذا لزم الأمر.
6. احتفظ بحبيبات الخلية على الثلج واعمل في غرفة باردة. املأ كوبا سعة 600 مل بالثلج وضع حامل أنبوب سعة 2 مل فوق الثلج.
   ملاحظه: من المفيد وضع حامل الأنبوب بالقرب من جانب الدورق ، بحيث يكون تعليق الحبيبات مرئيا في الجليد لمراقبة تقدم الصوتنة (انظر الشكل 1).
7. الدوامة تعليق الحبيبات في أنبوب 2 مل لفترة وجيزة لتجانس الخلايا, نفض الغبار على الأنابيب لإزالة أي خلايا في الجزء السفلي من الغطاء, ووضعها في حامل الأنبوب مع فتح الغطاء. اخفض طرف الصوتة في التعليق بحيث يكون تحت سطح السائل مباشرة.
8. إعداد إعداد الصوتنة كما هو موضح في الشكل 2 باستخدام سونيكتور ومسبار بقطر طرف 1/8 بوصة. أدخل الإعدادات التالية في التحكم في جهاز الصوت: تردد 20 كيلو هرتز وسعة 50٪ ، وقت تشغيل النبض: 10 ثوان ، وقت إيقاف النبض: 60 ثانية.
9. قم بتشغيل بروتوكول صوتنة النبض لمدة ثلاث دورات. إذا كان الحجم الإجمالي لتعليق الحبيبات > 500 ميكرولتر ، فقم بتشغيل بروتوكول صوتنة النبض ست مرات.
   ملاحظه: بشكل عام ، 3-6 نبضات كافية لتحليل V. natriegens الكريات. قد تكون هناك حاجة إلى نبضات إضافية اعتمادا على جهاز الصوت. أثناء الصوتنة ، استخدم منصة مقبض الضبط لتحريك المسبار لأعلى ولأسفل لتحلل أي حبيبات قد تكون قد استقرت في الجزء السفلي من الأنبوب. يمكن إزالة الأنبوب من الحامل ودوامه لفترة وجيزة لإعادة تجانس التعليق بين النبضات.
   أنذر: ارتد حماية السمع المناسبة عندما يكون جهاز الصوتات نشطا.
10. بعد الصوتنة ، قم بالطرد المركزي لمستخلص الخلية الخام عند 16,000 × جم لمدة 30-45 دقيقة عند 4 درجات مئوية أو حتى يصبح المحلل خاليا من أي حطام خلوي ، كما هو موضح في الشكل 3.
11. في غرفة باردة ، قم بإضافة 50 ميكرولتر من المواد الطافية الناتجة إلى أنابيب جديدة سعة 2 مل دون إزعاج الحبيبات.
    ملاحظه: أي حطام يتم نقله عن طريق الخطأ إلى الأنابيب الجديدة سعة 2 مل سيقلل بشكل كبير من قدرة المستخلص على تخليق البروتين عالي الغلة.
12. مستخلصات الخلايا الخام بالتجميد السريع عن طريق وضع الأنابيب في حامل أنبوب مع ربط خيط غمس ، كما هو موضح في الشكل 4. اغمر الأنابيب في ديوار يحتوي على نيتروجين سائل وضعها على الفور في الفريزر عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. أنذر: استخدم معدات الوقاية الشخصية المناسبة للتعامل مع النيتروجين السائل ، بما في ذلك معطف المختبر ونظارات السلامة وواقي الوجه ومئزر المبرد والقفازات.

الجدول 1: الكواشف لتحضير 1 لتر من وسائط نمو البكتيريا LB-V2 و 0.5 لتر من مخزن تحلل الخلية S30A.

الجدول 1 ألف	تحضير وسائط نمو البكتيريا LB-V2
مكون	الكمية (جم)	التركيز النهائي (ملي مولار)	المجلد النهائي (لتر)
مرق LB (ميلر)	25		1
كلوريد الصوديوم	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
KCl	0.31	4.2
الجدول 1 باء	تحضير S30A Lysis Buffer
مكون	الكمية (جم)	التركيز النهائي (ملي مولار)	المجلد النهائي (لتر)
محلول تريس (درجة الحموضة 8.0) - 1 متر (مل)*	25	50	0.5
ملغ-غلوتامات	2.72	14
K-غلوتامات	6.10	60
ديثيوثريتول (DTT) - 1 م (مل) *	1	2

النتائج

الشكل 1: منظر عن قرب لحامل الدورق والأنبوب على منصة الصوتنة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أنابيب 15 مل	كورنينج	352196
أنابيب 2 مل	إيبندورف	22363352
أنابيب 50 مل	كورنينج	352070
قارورة ديوار - 4 لتر	ثيرماسايفكتيفيك	10-194-100 درجة مئوية
حمض الجلوتاميك هيمي المغنيسيوم الملح رباعي الهيدرات	سيغما	49605
حمض الجلوتاميك أحادي هيدرات ملح البوتاسيوم	سيغما	جي 1149
مرق LB (ميلر)	سيغما	L3522
كلوريد المغنيسيوم (MgCl₂)	سيغما	م 8266
كلوريد البوتاسيوم (KCl)	سيغما	ص 9333
كريات هيدروكسيد البوتاسيوم	سيجما / روش	1050121000
Q125 Sonicator ومسبار CL-18	كسونيكا	4422
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)	سيغما	س7653
Vibrio natriegens (النوع البري) مخزون مجفف بالتجميد	ATCC	14048