تعبير البروتين الخالي من الخلايا باستخدام مستخلص الخلايا الخام البكتيري

الملخص

المصدر: Wiegand, D. J., et al. تعبير البروتين الخالي من الخلايا باستخدام بكتيريا الضمة الطبيعية سريعة النمو. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو استخدام نظام تعبير البروتين الخالي من الخلايا البكتيرية يعتمد على محللة البروتين الخام Vibrio natriegens لأداء النسخ والترجمة المقترنة في المختبر. يسلط الضوء على تحضير مزيج رئيسي بالمكونات الأساسية والتوليف خطوة بخطوة للبروتينات الوظيفية من قالب الحمض النووي.

البروتوكول

1. تحضير مكونات التفاعل الخالية من الخلايا

1. مكونات التفاعل العام
   1. تحضير مخزونات عاملة من Mg-glutamate و K-glutamate في أنابيب سعة 50 مل بماء معقم DI (منزوع الأيونات) بتركيزات 100 ملي مولار و 2000 ملي مولار على التوالي.
   2. قم بإعداد مخزون عامل بنسبة 50٪ (وزن / حجم) من البولي إيثيلين جلايكول (PEG) -8000 عن طريق إضافة 100 مل من ماء DI المعقم إلى دورق 250 مل. ضع محركا مغناطيسيا صغيرا في الكوب. قم بوزن 50 جم من PEG-8000 وأضفه إلى 100 مل من الماء في الدورق
   3. ضع الدورق على طبق تقليب ساخن على 100 درجة مئوية وحركه عند 250 دورة في الدقيقة حتى يصبح PEG-8000 في المحلول. اترك الخليط السائل PEG-8000 ليبرد قبل نقله إلى أنابيب 50 مل.
2. مزيج رئيسي لحلول الطاقة
   1. قم بإعداد محلول 5 أمتار من KOH عن طريق إضافة 140 جم من حبيبات KOH إلى 500 مل من ماء DI المعقم.
      أنذر: قم بإعداد هذا المحلول في غطاء كيميائي وارتد معدات الوقاية الشخصية عند التعامل مع القواعد القوية. سيصبح المحلول ساخنا ، لذا يجب أن يكون غطاء الزجاجة فضفاضا لمنع تراكم الضغط. اسمح لحل KOH بالوصول إلى RT قبل الاستخدام.
   2. قم بإعداد مخزن مؤقت Hepes-KOH سعة 1750 ملي موتر عن طريق إضافة 20.85 جم من HEPES إلى زجاجة سعة 100 مل. أضف الماء المعقم ببطء حتى يصل الحجم إلى 40 مل. زجاجة دوامة لإذابة HEPES. استخدم محلول 5 M KOH لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.0 ثم رفع حجم المحلول إلى 50 مل.
      أنذر: يجب التعامل مع KOH باستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند ضبط الرقم الهيدروجيني.
   3. قم بإعداد مكونات مخزون مزيج الطاقة الرئيسية المتبقية 10x بالتركيزات الموضحة في الجدول 1 في ماء DI المعقم وضع كل مخزون على الثلج. قم بإذابة مخزون 100 ملي مولار ATP و GTP و CTP و UTP في RT وضعه على الجليد.
      ملاحظه: يمكن استخدام الخلاط الحراري الذي تم ضبطه على 37 درجة مئوية و 350 دورة في الدقيقة لإذابة الكواشف في المحلول إذا لزم الأمر. لا تسخن أو تترك الكواشف على الخلاط الحراري لفترة طويلة من الزمن.
   4. في أنبوب سعة 15 مل ، أضف كل مكون من مكونات المزيج الرئيسي لمحلول الطاقة وفقا للترتيب والحجم المحددين في الجدول 1. دوامة الحل بعد إضافة كل مكون. سيؤدي ذلك إلى جعل 5 مل من مزيج رئيسي لحلول الطاقة 10x.
   5. قسم المزيج الرئيسي لمحلول الطاقة 10x إلى 200 ميكرولتر في أنابيب 2 مل. قم بتجميد كل حصة. ضعها على الفور في الفريزر -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3. مزيج رئيسي من الأحماض الأمينية
   1. لتحضير مزيج رئيسي طازج من الأحماض الأمينية 4x ، ابدأ بإذابة كل مخزون من الأحماض الأمينية في RT ثم وضع كل منها على الثلج. استخدم دوامة و / أو خلاط حراري مضبوطا على 37 درجة مئوية و 350 دورة في الدقيقة لضمان إذابة جميع مخزونات الأحماض الأمينية تماما.
      ملاحظه: قد لا يذوب السيستين تماما; يمكن إضافته إلى مزيج الأحماض الأمينية الرئيسي كمعلق. لا تسخن أو تترك الكواشف على الخلاط الحراري لفترة طويلة من الزمن.
   2. في أنبوب سعة 15 مل ، أضف الحجم المناسب من الأحماض الأمينية إلى ماء DI المعقم بحيث يكون التركيز النهائي لكل منها 8 ملي مولار بالترتيب التالي: ALA و ARG و ASN و ASP و GLEN و GLU و GLY و HIS و IIE و LYS و MET و PHE و PRO و SER و VAL و TRP و TYR و LEU و CYS. بعد إضافة كل حمض أميني ، قم بدوامة محلول المزيج الرئيسي. ستشكل الأحجام المدرجة في الجدول 1 2.4 مل من مزيج الأحماض الأمينية الرئيسي.
   3. قسم مزيج الأحماض الأمينية الرئيسية 4x إلى 200 ميكرولتر في أنابيب 2 مل. قم بتجميد كل حصة. ضعه على الفور في الفريزر عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4. إنتاج قالب الحمض النووي البلازميد الجاهز للتفاعل
   ملاحظه: تم تحسين تعبير البروتين الخالي من الخلايا في هذا النظام باستخدام ناقل التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) T7-pJL1-sfGFP (جدول المواد). يوصى باستخدام هذا البلازميد كعنصر تحكم في كفاءة التفاعل الخالي من الخلايا والعمود الفقري pJL1 لاستنساخ والتعبير عن تسلسلات البروتين الأخرى. يمكن استخدام قوالب الحمض النووي البلازميد الأخرى ؛ ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن النسخ يتم التحكم فيه عن طريق تسلسل محفز T7 ووجود بوليميراز T7 RNA. بروتوكول بسيط للإنتاج على نطاق واسع لأي قالب حمض نووي بلازميد من الإشريكية القولونية المحولة موصوفة أدناه.
   1. قم بتنقية المتجه المطلوب باستخدام مجموعة تنقية البلازميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد). ملاحظة: يوصى بتركيز قالب الحمض النووي البلازميد قدر الإمكان لتلبية قيود الحجم الضيقة للتفاعل الخالي من الخلايا. بشكل عام ، استهدف مخزون عمل 750-1500 نانوغرام / ميكرولتر.

2. إجراء تفاعلات التعبير عن البروتين الخالي من الخلايا باستخدام V. natriegens مستخلص خام

1. تعبير البروتين الخالي من الخلايا باستخدام قالب الحمض النووي البلازميد أو الخطي
   1. قم بإزالة مزيج محلول الطاقة الرئيسي 10x و 4x مزيج الأحماض الأمينية الرئيسي من الفريزر -80 درجة مئوية ، ثم قم بإذابة الثلج عند RT ، ثم ضعه على الثلج. قم بإزالة مخزون بوليميراز T7 RNA ومثبط RNase من الفريزر -20 درجة مئوية وضعها على الثلج. قم بإذابة قالب الحمض النووي في RT وضعه على الجليد.
   2. قم بإعداد مزيج رئيسي للتفاعل الخالي من الخلايا كما هو موضح في الجدول 2 عن طريق إضافة كل مكون بالترتيب التالي إلى أنبوب 2 مل على الثلج: مزيج رئيسي من الأحماض الأمينية ، مزيج رئيسي لمحلول الطاقة ، Mg-glutamate ، K-glutamate ، قالب DNA ، PEG-8000 ، بوليميراز T7 RNA ، ومثبط RNase. حرك الأنبوب برفق بعد كل إضافة إلى المزيج الرئيسي.
      ملاحظه: إذا كان سيتم استخدام قالب خطي للتعبير عن البروتين الخالي من الخلايا ، فقم بإضافة 5-10 أضعاف المواد مقارنة بقالب البلازميد للحصول على عوائد ملحوظة من البروتين.
   3. قم بإزالة محللة الخلايا الخام V. natriegens من المجمدات -80 درجة مئوية وضعها على الثلج لمدة 10-20 دقيقة حتى تذوب. أضف الحجم المناسب من مستخلص الخلايا الخام إلى المزيج الرئيسي للتفاعل الخالي من الخلايا كما هو موضح في الجدول 2 واخلطه برفق عن طريق النقر أو سحب العينة لأعلى ولأسفل.
   4. تعبير البروتين الخالي من الخلايا في نقطة النهاية باستخدام جهاز التدوير الحراري
      1. ماصة 10 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للتفاعل الخالي من الخلايا في قاع لوحة PCR ذات 96 أو 384 بئرا. بين كل عملية نقل إلى لوحة PCR ، امزج المزيج الرئيسي عن طريق تحريك الأنبوب برفق.
         ملاحظه: يجب خلط المزيج الرئيسي للتفاعل الخالي من الخلايا جيدا في جميع الأوقات لزيادة قابلية تكرار التفاعل وتعبير البروتين الخالي من الخلايا في جميع العينات.
   5. قم بالطرد المركزي لللوحة لفترة وجيزة عند 1,000 × جم لمدة 10 ثوان لتجميع أي مزيج رئيسي قد يكون عالقا على جوانب الآبار. أغلق الآبار بمادة لاصقة لمنع التبخر ، ثم ضع لوحة PCR في جهاز تدوير حراري عند 26 درجة مئوية مع غطاء ساخن عند 105 درجة مئوية.
      ملاحظه: يعمل التوزيع المتساوي للحرارة والغطاء الساخن لجهاز التدوير الحراري على تحسين إنتاجية تعبير البروتين بشكل كبير.
   6. احتضان التفاعلات الخالية من الخلايا لمدة 3 ساعات على الأقل. بعد الحضانة ، يمكن تنقية البروتينات المسبوب عنها وقياسها كميا واستخدامها في العمليات النهائية.
      ملاحظه: يمكن قياس البروتينات المعبر عنها مباشرة في التفاعل الخالي من الخلايا باستخدام طريقة يختارها المستخدم. على سبيل المثال ، يمكن قياس بروتينات الفلورسنت باستخدام منحنى قياسي خارجي ، أو يمكن قياس النشاط الإشعاعي إذا كنت تستخدم أحماض أمينية تحمل علامة إشعاعية في التفاعل الخالي من الخلايا. لا ينصح عموما بالتحليل الطيفي المرئي للأشعة فوق البنفسجية أو فحوصات البروتين الكلي لقياس إنتاج البروتين مباشرة في تفاعلات خالية من الخلايا دون تنقية أولية.

الجدول 1: الكواشف لتحضير 5 مل من المزيج الرئيسي لمحلول الطاقة 10x و 2.4 مل من مزيج رئيسي من الأحماض الأمينية 4x.

تحضير 10x Energy Solution Master Mix
مكون	تركيز المخزون (ملي)	التركيز النهائي (ملي مولار)	الكمية (ميكرولتر)	الحجم النهائي (ميكرولتر)
هيبس-KOH درجة حموضة 8	1750	500	1428.57	5000
ATP	100	15	750.00
جي تي بي	100	15	750.00
CTP	100	9	450.00
UTP	100	9	450.00
الحمض النووي الريبي المرسال من الإشريكية القولونية MRE 600 (ملغم/مل)*	100	2	100.00
إنزيم أ هيدرات	200	2.6	65.00
NAD	200	3.3	82.50
معسكر	650	7.5	57.69
حمض الفولينيك	100	0.7	35.00
سبيرميدين	1600	10	31.25
3-PGA	2000	300	750.00
مياه معقمة منزوعة الأيونات			49.99
	تحضير 4x مزيج رئيسي من الأحماض الأمينية
مكون	تركيز المخزون (ملي)	التركيز النهائي (ملي مولار)	الكمية (ميكرولتر)	الحجم النهائي (ميكرولتر)
علاء	168	8	114.3	2400
الارجنتين	168	8	114.3
إس إن	168	8	114.3
ASP	168	8	114.3
GLN	168	8	114.3
غلو	168	8	114.3
GLY	168	8	114.3
صفحته	168	8	114.3
IIE	168	8	114.3
ليز	168	8	114.3
اجتمع	168	8	114.3
PHE	168	8	114.3
برو	168	8	114.3
SER	168	8	114.3
ثر	168	8	114.3
فال	168	8	114.3
الحزب	168	8	114.3
صور	168	8	114.3
لوي	140	8	137.1
CYS	168	8	114.3
مياه معقمة منزوعة الأيونات			91.4

الجدول 2: مكونات المزيج الرئيسي للتفاعل الخالي من الخلايا V. natriegens المحسن لقالب الحمض النووي

مزيج تفاعل ماستر خال من الخلايا
مكون	تركيز المخزون (ملي)	التركيز النهائي (ملي مولار)	الكمية (ميكرولتر) 1x تفاعل	الكمية (ميكرولتر) 50x ردود الفعل
مستخلص (٪)		25	2.50	125.00
ملغ-غلوتامات	100	3.5	0.35	17.50
K-غلوتامات	2000	80	0.40	20.00
4x حمض أميني ماستر ميكس	8.0	2	2.50	125.00
10x مزيج رئيسي لحلول الطاقة			1.00	50.00
الحمض النووي البلازميد (نانوغرام / ميكرولتر)	1000	500	0.50	25.00
50٪ PEG-8000 (٪)	50	2	0.40	20.00
T7 RNA بوليميراز			1.00	50.00
مثبط RNase ، الفئران			0.10	5.00
مياه معقمة منزوعة الأيونات			1.25	62.50
حجم التفاعل (ميكرولتر):	10

المواد