تعبير البروتين الخالي من الخلايا باستخدام مستخلص الخلايا الخام البكتيري

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Wiegand, D. J., et al. تعبير البروتين الخالي من الخلايا باستخدام بكتيريا الضمة الطبيعية سريعة النمو. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو استخدام نظام تعبير البروتين الخالي من الخلايا البكتيرية يعتمد على محللة البروتين الخام Vibrio natriegens لأداء النسخ والترجمة المقترنة في المختبر. يسلط الضوء على تحضير مزيج رئيسي بالمكونات الأساسية والتوليف خطوة بخطوة للبروتينات الوظيفية من قالب الحمض النووي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير مكونات التفاعل الخالية من الخلايا

مكونات التفاعل العام
1. تحضير مخزونات عاملة من Mg-glutamate و K-glutamate في أنابيب سعة 50 مل بماء معقم DI (منزوع الأيونات) بتركيزات 100 ملي مولار و 2000 ملي مولار على التوالي.
2. قم بإعداد مخزون عامل بنسبة 50٪ (وزن / حجم) من البولي إيثيلين جلايكول (PEG) -8000 عن طريق إضافة 100 مل من ماء DI المعقم إلى دورق 250 مل. ضع محركا مغناطيسيا صغيرا في الكوب. قم بوزن 50 جم من PEG-8000 وأضفه إلى 100 مل من الماء في الدورق
3. ضع الدورق على طبق تقليب ساخن على 100 درجة مئوية وحركه عند 250 دورة في الدقيقة حتى يصبح PEG-8000 في المحلول. اترك الخليط السائل PEG-8000 ليبرد قبل ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي
أنابيب 15 مل	كورنينج	352196
أنابيب 2 مل	إيبندورف	22363352
384 بئر لوحات الفحص الأسود	كورنينج	3544
لوحات PCR 384 بئر	إيبندورف	951020702
أنابيب 50 مل	كورنينج	352070
لوحات PCR 96 بئر	إيبندورف	30129300
الأدينوزين 3 '، 5'-أحادي الفوسفات الدوري أحادي الفوسفات أحادي الهيدرات	سيغما	أ6885
الأدينوزين 5'-ثلاثي الفوسفات - 100 ملي	نيب	N0450 لتر
جهاز التدوير الحراري للأنظمة الحيوية التطبيقية Veriti 384 بئر	ثيرموفيشر	4388444
المواد اللاصقة للوحة الفحص	بيوراد	MSB1001
β-نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد هيدرات (NAD)	سيجما / روش	10127965001
أنزيم أ هيدرات	سيغما	سي 4283
سيتيدين 5'-ثلاثي الفوسفات - 100 ملي	نيب	N0450 لتر
د- (-) -3-ملح ثنائي الصوديوم حمض الفوسفوجليسريك (3-PGA)	سيغما	ص 8877
قارورة ديوار - 4 لتر	ثيرماسايفكتيفيك	10-194-100 درجة مئوية
محلول DL-Dithiothreitol - 1 M	سيغما	42816
حمض الفولينيك ، ملح الكالسيوم ، هيدرات	سيغما	47612
حمض الخليك الجليدي	سيغما	أ 6283
جوانوزين 5'-ثلاثي الفوسفات - 100 ملي	نيب	N0450 لتر
HEPES	سيغما	[إتش3375]
حمض الجلوتاميك هيمي المغنيسيوم الملح رباعي الهيدرات	سيغما	49605
حمض الجلوتاميك أحادي هيدرات ملح البوتاسيوم	سيغما	جي 1149
كلوريد المغنيسيوم (MgCl₂)	سيغما	م 8266
البلازميد pJL1-sfGFP	أدجين	69496
طقم Plasmid Plus Maxi	كياجين	12963
بولي (إيثيلين جلايكول) (PEG) -8000	سيغما	89510
كلوريد البوتاسيوم (KCl)	سيغما	ص 9333
كريات هيدروكسيد البوتاسيوم	سيجما / روش	1050121000
مثبط RNase ، الفئران	نيب	م0314
جهاز أخذ عينات الأحماض الأمينية RTS	Biotechrabbit	BR1401801
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)	سيغما	س7653
سبيرميدين	سيغما	س 0266
T7 RNA بوليميراز	نيب	إم 0251
محلول تريس (درجة الحموضة 8.0) - 1 م	إنفيتروجين	AM9856
الحمض النووي الريبي من الإشريكية القولونية MRE 600	سيجما / روش	10109541001
يوريدين 5'-ثلاثي الفوسفات - 100 ملي	نيب	N0450 لتر
Vibrio natriegens (النوع البري) مخزون مجفف بالتجميد	ATCC	14048

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن